揚州市結(jié)核分枝桿菌分子分型及耐藥性監(jiān)測.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)引起的一種慢性傳染病，主要感染人的呼吸道系統(tǒng)。據(jù)WHO估計，世界上近三分之一的人口已感染結(jié)核分枝桿菌。雖然TB流行水平呈下降趨勢，但每年新發(fā)病例仍突破900萬例，并且，隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，對結(jié)核病的治療和防控造成很大的挑戰(zhàn)。因此，結(jié)核分枝桿菌菌種的鑒定分型以及耐藥性監(jiān)測對于該病的診斷、治療以及

2、預后都有著重要的意義。本研究針對結(jié)核分枝桿菌揚州臨床分離株，運用傳統(tǒng)細菌學方法和多位點PCR相結(jié)合，初步鑒定分枝桿菌的種屬，再利用MIRU-VNTR和Spoligotyping分型方法研究其流行病學特征，最后通過比例法、MIC和耐藥基因檢測分析結(jié)核分枝桿菌耐藥性情況。
　　1揚州市結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定
　　用抗酸染色實驗確定抗酸桿菌陽性后，用PNB/TCH試驗和多位點PCR從抗酸桿菌陽性菌株中鑒定出結(jié)核分枝桿菌（My

3、cobacterium tuberculosis, MTB），并比較兩個方法之間的差異。結(jié)果顯示，289株抗酸染色陽性臨床分離株，經(jīng)過PNB/TCH試驗和多位點PCR進一步鑒定，其中270株為MTB，9株為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，2株為M.africanum，剩余8株需進一步鑒定。PNB/TCH試驗結(jié)果與多位點PCR結(jié)果無統(tǒng)計學顯著性差異。鑒定結(jié)果表明，揚州市結(jié)核病例絕大多數(shù)是由

4、結(jié)核分枝桿菌所引起的，但也存在非結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。
　　2結(jié)核分枝桿菌揚州分離株的分子分型研究
　　CTAB法提取到270株MTB分離株基因組DNA，用MIRU-VNTR和Spoligotyping進行基因分型。Spoligotyping方法共區(qū)分出8個家族，其中北京家族233株、T1家族15株、未知家族菌株11株、相似北京家族4株、U家族3株、H3家族2株、MANU2家族1株、T2家族1株。MIRU-VNTR方法共

5、區(qū)分出154個基因型，其中144株組成28個簇，剩余126株均為獨立基因型，該方法的分辨力為0.960。在15個VNTR位點中，不管是對全部菌株還是只對北京家族進行分析，Mtub21位點的HGDI值均為最高，分別為0.545和0.451。MIRU-VNTR分型方法的分辨率(0.960)明顯高于Spoligotyping方法的分辨力(0.253)，且兩種分型方法相結(jié)合會使分辨力更高。通過分型研究，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌揚州分離株具有一定的基

6、因多態(tài)性，北京家族基因型菌株為該市的主要流行菌株，其流行趨勢具有高度集中性，同時Spoligotyping方法也發(fā)現(xiàn)了11個新基因型，豐富了SpolDB4數(shù)據(jù)庫。
　　3結(jié)核分枝桿菌揚州分離株的耐藥表型及耐藥基因分析
　　通過傳統(tǒng)比例法和MIC方法對174株臨床表現(xiàn)為耐藥的分離株進行耐藥性檢測，并針對鑒定為耐藥的菌株進行耐藥基因的測序（主要針對四種一線藥:異煙肼INH、利福平RFP、鏈霉素SM、乙胺丁醇EMB）。傳統(tǒng)比例法耐

7、藥性結(jié)果顯示174株MTB中有72株耐藥(41.4％)，多重耐藥菌株有32株(18.4％)。對72株耐藥菌株的耐藥性檢測方面，MIC法與傳統(tǒng)比例法的結(jié)果之間無統(tǒng)計學顯著性差異。耐藥基因比對結(jié)果顯示，INH耐藥菌株中，katG突變率為72.0％(36/50)，inhA突變率為6.0％(3/50);RFP耐藥菌株中，rpoB突變率為67.5％(27/40);EMB耐藥菌株中，embB突變率為52.6％(10/19);SM耐藥菌株中，rrs突

8、變率為15.4％(6/39)，rpsL突變率為71.8％(28/39)。通過比對分析，耐藥基因的突變與結(jié)核分枝桿菌耐藥表型密切相關(guān)，出現(xiàn)耐藥表型的菌株不一定發(fā)生耐藥基因突變，但是耐藥基因突變的菌株全部耐藥。
　　本研究以揚州市2012-2015年結(jié)核分枝桿菌為對象，通過分離鑒定、分子分型、藥物敏感性試驗和耐藥基因突變位點分析等檢測，在分子水平分析揚州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的分布和傳播特征，為該地區(qū)結(jié)核病的防治策略的訂制提供科學參考依據(jù)，