應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的實驗研究.pdf

1、目的：1.探究流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼敏感性的實驗條件。
　　2.建立一種能較清晰區(qū)分藥物損傷與活結(jié)核分枝桿菌的流式染色方案。
　　方法：1.摸索FDA法流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼（INH）敏感性的實驗條件。①利用標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv調(diào)試流式方案，并通過檢測死活混合比例予以驗證，同時根據(jù)上機速度確定菌液濁度。②通過比較13株敏感結(jié)核分枝桿菌與不同INH濃度（10ug/ml、100ug/ml）分別作用24、48、

2、72h后的敏感指數(shù)（Susceptibility Index，SI），確定其最適宜的INH濃度與作用時間。③比較加入多聚甲醛處理10min、40min及未加多聚甲醛的平均熒光強度（Mean fluorescent intensity，MFI）及SI的差別，了解多聚甲醛對藥敏結(jié)果的影響。④檢測25株已知藥敏結(jié)果的敏感及耐藥菌的SI值，確定敏感及耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以此為基礎(chǔ)檢測33株臨床分離株的藥敏結(jié)果并與傳統(tǒng)的比例法檢測結(jié)果進行比較。2.其

3、他熒光染料的進一步探究。分別用6-cFDA、CTC、PI單染料和SYTO9及PI、6-cFDA及PI雙染料的不同染色方案檢測結(jié)核分枝桿菌對INH的敏感性，選定一種能較清晰區(qū)分INH損傷菌與活菌的染色方案，并以此為基礎(chǔ)檢測38株臨床分離株。
　　結(jié)果：1.析因設(shè)計方差分析結(jié)果提示INH濃度為100ug/ml作用72h的條件下SI最低，INH損傷菌與活菌的MFI差異最大，為檢測結(jié)核分枝桿菌對INH敏感性的最適宜條件。2.敏感菌的SI為

4、0.48±0.23，耐藥菌的SI為0.95±0.16，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且無重疊，因此將SI≥0.725設(shè)定為敏感的判斷標(biāo)準(zhǔn)。3.加入多聚甲醛會使的MFI下降，而多聚甲醛作用10min與40min的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是是否加入多聚甲醛對SI無影響。4.33株臨床分離菌株的流式法藥敏結(jié)果與比例法結(jié)果一致（P=0.688），符合率為84.85％。5.6-cFDA與FDA相比，前者的SI更低，即能更好的區(qū)分INH損傷菌與活菌，而CTC與

5、FDA類似。6.6-cFDA及PI雙染料方案能較清晰區(qū)分INH損傷菌與活菌，將可應(yīng)用于異質(zhì)性耐藥的研究。
　　結(jié)論：確定流式細胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼敏感性的適宜實驗條件：菌液濁度為McFarland No.1，異煙肼終濃度為100ug/ml，作用時間為72h；加入多聚甲醛可以滅活結(jié)核分枝桿菌，在提高生物安全條件的同時，仍可以獲得準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果；初步建立能較清晰區(qū)分藥物損傷菌與活菌的以6-cFDA與PI組成的雙染流式細胞術(shù)染色