結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性及其環(huán)絲氨酸耐藥分子特征的初步研究.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)分析結(jié)核分枝桿菌對(duì)14種常見抗結(jié)核藥物的敏感性；分析微孔板刃天青顯色法用于結(jié)核分枝桿菌環(huán)絲氨酸（D-Cycloserine，DCS）藥物敏感性的檢測(cè)并評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果；結(jié)合間隔區(qū)寡核苷酸基因分型（Spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping），探討DCS耐藥性與北京家族基因型菌株的關(guān)聯(lián)性；探索結(jié)核分枝桿菌DCS耐藥性與可能的靶酶alrA、ddlA和cycA基因突變的關(guān)系，為我

2、國(guó)結(jié)核病的防治提供相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。
　　材料方法：
　　1.145株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所（以下簡(jiǎn)稱傳染病所）菌株庫(kù)中選取，分別來源于福建、廣西、河南、湖南、四川、新疆和西藏等省級(jí)結(jié)核病防治所或結(jié)核病醫(yī)院，由傳染病所結(jié)核室進(jìn)行菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌并進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv也由傳染病所提供。
　　2.用微孔板刃天青顯色法（Resazurin microt

3、iter assay，REMA）檢測(cè)145株臨床分離株對(duì)14種常見抗結(jié)核藥物的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。采用固體羅氏培養(yǎng)基比例法確定所選結(jié)核分枝桿菌菌株DCS耐藥表型；將菌株MIC數(shù)值通過log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，用ROC曲線（Receiver operatingcharacteristiccurve）判斷DCS藥敏臨界值。
　　3.對(duì)所選的臨床分離株進(jìn)行 Spoligot

4、yping基因分型鑒定，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度分析北京基因型與DCS耐藥表型是否存在關(guān)聯(lián)性。
　　4.查閱文獻(xiàn)篩選DCS最可能的相關(guān)靶基因alrA、ddlA和cycA，采用Primier5.0設(shè)計(jì)引物， PCR擴(kuò)增、DNA直接測(cè)序法測(cè)定目的基因全長(zhǎng)；用 Bioedit7.1.10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的序列比對(duì)分析，了解相關(guān)基因的突變情況。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)氨基水楊酸、莫西沙星、左氧氟沙星、乙胺丁醇、鏈霉素 MI

5、C50較低，利福噴汀、利福平、異煙肼和環(huán)絲氨酸的MIC50較高。對(duì)氨基水楊酸、妥布霉素和莫西沙星的MIC90較低，利福噴汀、異煙肼、環(huán)絲氨酸、鏈霉素和利福平的MIC90較高。結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)一二線抗結(jié)核藥物的敏感性分布呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。
　　2.比例法檢測(cè)145株臨床分離株的DCS藥敏結(jié)果為24株耐藥，121株為敏感株。采用REMA檢測(cè)這些菌株的DCS藥敏，比例法檢測(cè)的耐藥的菌株中，5株菌株的MIC為16μg/ml；12株菌株的

6、MIC為32μg/ml；6株菌株的MIC為64μg/ml；1株菌株的MIC為128μg/ml；而比例法檢測(cè)為敏感的菌株中，1株的MIC為1μg/ml；3株為2μg/ml；16株為4μg/ml；43株為8μg/ml；58株為16μg/ml。ROC曲線分析顯示曲線下面積AUC為0.950，P值＜0.001。Youden指數(shù) J=0.79。Medcale軟件判定最佳臨界值為16μg/ml。此時(shí)，以比例法檢測(cè)結(jié)果做參照，微孔板刃天青顯色法的靈敏

7、度和特異度分別為79.17％和100%，診斷符合率為96.55%。
　　3. Spoligotyping基因分析對(duì)145株臨床分離株Spoligotyping的雜交結(jié)果指紋圖譜進(jìn)行分析，與國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)SpolDB4.0進(jìn)行比對(duì)。統(tǒng)計(jì)分析北京家族基因型為88株，占60.7%（88/145），包括86株經(jīng)典型北京家族株，2株為非典型北京家族株。非北京家族菌株為57株，占比為39.3%（57/145）。非北京家族中，大部分為T家族，占非北

8、京家族比例為35.1%（20/57），17株為新發(fā)現(xiàn)菌株基因型，占29.8%（17/57）。88株北京基因型家族中DCS耐藥為18株，耐藥率為20.5%(18/88)，57株非北京基因型家族中DCS耐藥為6株，耐藥率為10.5%(6/57)，兩者耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.47, P＞0.05)。
　　4.DCS耐藥菌株中alrA突變率為4.2%(1/24)，突變株261位AGC→AAC(Ser→Asn)，一株敏感株alrA

9、基因337位GGT→GGC，為Gly同義突變。耐藥菌株中未發(fā)現(xiàn)ddlA突變，僅一株敏感株92位CGT→CGC，為Arg同義突變。DCS耐藥菌株中cycA突變率為12.50%（3/24），分別為188位CCT→GCT(Pro→Ala)、318位CGA→CTA(Arg→Leu)和508位GCA→TCA(Ala→Ser)。DCS敏感株中cycA存在2種同義突變，分別為521位CGT→CGC(Arg)和406位TCG→TCA(Ser)，其中40

10、6位突變有兩株菌株。
　　結(jié)論：
　　1.首次采用微孔板刃天青顯色法初步了解了結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株對(duì)14種常用抗結(jié)核藥物敏感性的MIC譜。
　　2.研究建立了檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸敏感性的微孔板刃天青顯色法，并首次通過ROC曲線確定了結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸敏感性的閾值為16μg/ml，具有很好的應(yīng)用效果，并且該法具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低的優(yōu)點(diǎn)，推廣應(yīng)用的前景良好。
　　3.結(jié)合Spoligotyping分型