基于定點切除和COLD-PCR技術(shù)對基因損傷的檢測.pdf

1、DNA損傷是在基因復(fù)制過程中導(dǎo)致的基因核苷酸序列的改變，同時導(dǎo)致遺傳特征的變化。研究表明，許多腫瘤癌癥的發(fā)生與基因損傷有著重要的聯(lián)系。目前已經(jīng)有一些對DNA損傷的檢測和修復(fù)技術(shù)的研究，對分子診斷有著一定的輔助作用。
　　COLD-PCR作為PCR的一種新模式，能夠在不改變常規(guī)PCR反應(yīng)所用試劑和儀器的情況下選擇性的對損傷和突變的目的基因進行擴增，起到對目的基因特異性富集的作用。
　　本研究通過對損傷基因的定點切除和修復(fù)，結(jié)合

2、COLD-PCR的檢測手段，建立一種對DNA損傷進行檢測的新方法，長度為200bp的DNA序列發(fā)生單堿基變化時其Tm值會產(chǎn)生0.5-2.0℃的變化。在對含有損傷的DNA寡核苷酸鏈進行檢測的過程中，發(fā)現(xiàn)在堿基切除修復(fù)后進行COLD-PCR實時熒光定量擴增的結(jié)果中可以顯示出該方法對于基因損傷檢測的效果，并能實現(xiàn)對不同損傷基因個數(shù)的檢測。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，降低目標(biāo)鏈中損傷基因相對于正?；虻谋壤_到對損傷基因0.01％的檢測豐度。并且降低修

3、復(fù)酶的使用濃度，基于本實驗的方法相對于報道過的其他方法體現(xiàn)出修復(fù)酶靈敏性的優(yōu)勢。
　　將該方法應(yīng)用于細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)對實際細(xì)胞樣品中DNA損傷的檢測，且能夠?qū)Σ煌潭鹊膿p傷加以對比和區(qū)分。實驗還發(fā)現(xiàn)不同的活性氧物種能夠引起DNA的氧化損傷，可能作為導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷從而對癌癥的治療提供一個新的潛在途徑。
　　本文建立的將定點切除技術(shù)和COLD-PCR結(jié)合的方法實現(xiàn)了對基因損傷的檢測，使用常見的檢測設(shè)備、操作相對簡單，