基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)與應(yīng)用.pdf

1、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因研究的必要環(huán)節(jié)。本研究以Micro-Tom番茄和金柑為試材，建立了快速提取DNA用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株和構(gòu)建重組質(zhì)粒篩選最佳引物體系，并應(yīng)用質(zhì)粒添加實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因金柑的拷貝數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)適于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的DNA快速制備技術(shù)
　　 以番茄葉片為試材，建立了一種簡(jiǎn)便快速制備葉片基因組DNA的方法。利用煮沸法提取番茄葉片，可以在30 min內(nèi)完成12

2、個(gè)樣品的DNA制備。同時(shí)確定葉片面積大小從2 mm2至50 mm2，在12.5μL的PCR體系中添加0.1μL-0.2μL的DNA模板，均可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。結(jié)果表明，建立的實(shí)時(shí)定量PCR體系能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，根據(jù)目標(biāo)基因HPT和內(nèi)標(biāo)基因ELIP的Ct差值(△Ct)，應(yīng)用2(1-△Ct)可以判斷目標(biāo)基因是否插入。
　　 (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及最佳引物對(duì)的篩選
　　 利用分子生物學(xué)技術(shù)在番茄中構(gòu)建了包含目標(biāo)基因HPT和番茄

3、內(nèi)標(biāo)基因ELIP的重組質(zhì)粒HPT-ELIP，并應(yīng)用10000 copy·μL-1的濃度篩選出適合實(shí)時(shí)定量PCR的最佳引物對(duì)P438+P439和SP061+SP062。同時(shí)在金柑中構(gòu)建了包含目標(biāo)基因NPTII和金柑內(nèi)標(biāo)基因CS的重組質(zhì)粒CS-NPTII，同時(shí)應(yīng)用10000 copy·μL-1的濃度篩選出實(shí)時(shí)定量PCR的最佳引物對(duì)CS001+CS002和SP069+SP070，用于下一步準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)基因金柑拷貝數(shù)。
　　 (3)建立了