轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品的實時熒光定量PCR檢測.pdf

1、MON88017是Monsanto公司通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將含有cry3Bb1和cp4 epsps兩個基因表達盒的質(zhì)粒載體PV-ZMIR39導(dǎo)入玉米Hi-II細胞中得到的轉(zhuǎn)基因玉米品系。對MON88017的分子生物學(xué)分析證實，只有單一拷貝的cp4 epsps和cry3Bb1基因表達盒整合到MON88017的基因組中的單一位點上；各種表達元素完好無損；沒有任何細菌質(zhì)粒骨架序列插入MON88017基因組。
　　本實驗采用基因組步移

2、法和巢式 PCR方法測定出 MON88017外源 DNA導(dǎo)入位點旁側(cè)序列，并根據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計轉(zhuǎn)化體特異性(event specific)PCR檢測引物，進行定性PCR擴增，確定了引物的最佳反應(yīng)條件，從而建立起該轉(zhuǎn)基因玉米品系的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法。在定性PCR基礎(chǔ)上，設(shè)計合適的引物和探針，利用定量 PCR擴增儀進行熒光實時定量 PCR擴增，通過與標準曲線比對，確定產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量，從而建立起一套完整的抗蟲抗除草劑玉米MON88017

3、及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分定量檢測體系。詳細結(jié)果如下:
　　(1)采用基因組步移法和巢式 PCR方法獲得轉(zhuǎn)基因玉米 MON88017外源基因插入位點的左邊界旁側(cè)序列504bp。序列同源性分析表明，從5'端開始前168bp為玉米基因組序列，從第169bp至3'末端為插入到玉米中的載體序列，其中從第169bp~479bp為間插序列，從第480bp至3'末端為水稻中啟動子 P-ract1部分序列。
　　(2)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米 MON8801

4、7左邊界序列，采用Primer premier5.0軟件設(shè)計了3對MON88017轉(zhuǎn)化體特異性引物，對3對特異性引物進行篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，確定最適的特異性引物MON88017-1F/R(446bp)，其最適退火溫度為56℃。通過驗證，該引物MON88017-1F/R具有較高的特異性和準確性。用特異性引物MON88017-1F/R對不同濃度的DNA進行檢測表明，在MON88017 DNA稀釋至0.1％時，仍能擴增出446 bp的特異性目

5、的片段，說明該轉(zhuǎn)基因玉米的最低檢測極限(即靈敏度)較高，為0.1％。該定性PCR方法完全可以滿足轉(zhuǎn)基因玉米品系的轉(zhuǎn)化體特異性檢測的要求。
　　(3)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米 MON88017左邊界序列，采用Primer Express2.0軟件設(shè)計了轉(zhuǎn)化體特異性定量引物MON88017-F/R(87bp)和Taqman探針MON88017-P，通過篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，確定其最適退火溫度為60℃。進行實時熒光定量 PCR檢測，Taqman探針