轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測體系的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)基因大豆MON8978是美國孟山都公司研發(fā)的抗草甘膦大豆品種，中國在2008年批準其作為加工原料進口。本文旨在建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測體系，為轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的安全監(jiān)管提供技術(shù)和理論支持。本研究主要包括以下兩部分:
　　實驗一旨在優(yōu)選出合適的大豆及主要豆制品DNA提取方法，為轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測中DNA提取方法的比較評估的提供一套參考體系。實驗以大豆、豆奶粉、豆腐干、大豆蛋白和豆粕為材料

2、，選擇了CTAB法、SDS法和Tiangen離心柱試劑盒法，并根據(jù)實際檢測需要對其進行了改動，3種方法提取的DNA通過紫外分光光度法和實時熒光PCR法檢測DNA質(zhì)量，選出最佳的DNA提取方法。結(jié)果顯示:與SDS法和Tiangen離心柱試劑盒法相比，CTAB法提取的大豆及主要豆制品的DNA質(zhì)量較高，更能夠保證轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測結(jié)果的準確性，并且成本低、操作簡便。因此，對于大豆及豆奶粉、豆腐干、大豆蛋白、豆粕等豆制品，CTAB法是3種方法

3、中最合適的DNA提取方法，適用于轉(zhuǎn)基因檢測中DNA模板的制備。
　　實驗二旨在建立一種轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性實時熒光PCR檢測方法，為轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的快速檢測提供技術(shù)和理論支持。實驗構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒標準分子pUC19-LM5，其包含轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列和大豆內(nèi)標準基因lectin。以質(zhì)粒標準分子pUC19-LM5為陽性標準品建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法

4、，并對建立的實時熒光PCR方法進行方法學評價。結(jié)果顯示:建立的方法高度特異于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788檢測;2個目標片段的檢測極限(LOD)為4拷貝質(zhì)粒標準分子DNA，定量極限(LOQ)為10拷貝質(zhì)粒標準分子DNA;構(gòu)建的標準曲線反應效率大于95％，相關(guān)系數(shù)大于0.99;3個盲樣的定量分析中，測量值與設(shè)定值間的偏差(Bias)在-14.81％～9.81％之間，測量值的相對標準偏差(RSD)在2.72％～6.28％之間。此外，建立的實時熒