檢測豬肺表面活性蛋白A-D基因實時熒光定量和納米PCR方法的建立.pdf

1、表面活性蛋白A（surfactant proteins，SP-A）和表面活性蛋白D(surfactant proteins，SP-D)對肺部的發(fā)育、成熟起到重要作用。SP-A和SP-D基因的表達量與呼吸系統(tǒng)免疫防御息息相關，對肺部的異常病變具有指示作用，所以可以作為多種肺部疾病的生物標記。為檢測體內SP-A/SP-D基因，本研究建立了兩種檢測方法:即熒光定量PCR方法和納米金PCR方法，并且驗證這兩種方法的特異性及靈敏性。
　　

2、 根據(jù)豬SP-A基因序列（NM_214265.1）和豬SP-D基因序列(NM_214110)設計特異性引物，將SP-A的CDS區(qū)(750bp)和SP-D的CDS區(qū)(1137bp)分別鏈接至PMD-18T載體，構建了豬SP-A基因和SP-D基因CDS區(qū)全序列重組質粒PMD-SP-A和PMD-SP-D。設計并合成了特異性的引物和探針，以重組質粒為標準品，對探針、引物等濃度及退火溫度進行優(yōu)化，建立了豬SP-A/SP-D基因的TaqMan熒光定

3、量PCR方法。實驗結果顯示:所建立熒光定量PCR檢測方法為異性擴增;SP-A基因檢測下限達到2.50×101 copies/μl，而SP-D基因更是達到100copies/μl（約3copies）;批內及批間變異系數(shù)均小于2.5％;擴增效率在98％-108％之間。本實驗建立的豬SP-A/SP-D基因TaqMan熒光定量PCR方法敏感性高、重復性好、特異性強，可以用于豬SP-A/SP-D基因的定量檢測。
　　 沿用熒光定量PCR方

4、法的特異性引物，以SP-A/SP-D重組質粒為模板，優(yōu)化反應條件，建立了納米金PCR（Nano PCR）方法，并對其靈敏度進行了測定。由于一些研究推測，納米金能夠替代PCR反應體系中的鎂離子，為了檢驗這一推論，實驗設計兩組PCR反應體系，一組無鎂離子，一組添加鎂離子。實驗結果表明:Nano PCR法亦能擴增得到與實驗設計相符的特異性條帶，靈敏度與熒光PCR方法相當，SP-A基因檢測下限達2.53×101copies/μl，SP-D基因達

5、到100copies/μl（約3copies）。在實驗組中，無鎂離子的實驗組能靈敏地擴增出特異性條帶，但添加鎂離子的對照組檢測靈敏度要更好，說明納米金粒子可以起到反應體系中的鎂離子的作用，而鎂離子與納米金粒子兩種粒子對PCR反應效果的增強作是相對獨立的，不是簡單的替代關系。
　　 為了對比，本研究使用ExTaq酶，以重組質粒為模板，進行反應體系和反應條件優(yōu)化，構建了SP-A/SP-D基岡的普通PCR檢測方法。用普通PCR方法檢測

6、SP-A/SP-D基因的靈敏度下限僅為104copies/μl，其靈敏度遠小于熒光定量PCR方法和Nano PCR方法。對比實驗證明，本研究所建立的兩種檢測方法比普通PCR檢測效率要高。
　　 本研究創(chuàng)造性地為檢測微量SP-A/SP-D基因提供了一套高效雙保險檢測方法。從理論上講，探針法熒光定量PCR能準確定帶檢測目的基因，將這一方法應用到豬SP-A/SP-D基因的研究中，能夠達到檢測目的基因含量的要求，為這兩種基因的后續(xù)研究奠

7、定了基礎。而NanoPCR是一種新興的PCR方法，目前對于Nano PCR的研究仍然甚少，本實驗為Nano PCR的廣泛應用做了進一步探索，雖然Nano PCR方法不能準確檢測出目的基因的含量，但其有著靈敏性高、特異性好的特點，而且成本較熒光PCR方法要小很多。從實際意義上講，近些年對豬SP-A/SP-D基因的研究正在逐步深入，已經證實這兩種基因對多種肺部疾病都有指示作用，但仍沒有高靈敏度定量PCR檢測方法出現(xiàn)，本研究所建立的兩種檢測S