土壤中茄鏈格孢半巢式和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、由茄鏈格孢(Alternaria solani)引起的馬鈴薯早疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上一種重要的葉部病害。土壤中茄鏈格孢的數(shù)量和病害的發(fā)生程度具有明顯相關(guān)性，是預(yù)測馬鈴薯早疫病發(fā)生的重要前提條件之一。本研究為了準(zhǔn)確快速明確馬鈴薯生育期土壤中茄鏈格孢的發(fā)生動(dòng)態(tài)，擬建立半巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測技術(shù)開展土壤中早疫病菌檢測的研究工作，主要研究結(jié)果如下:
　　1.以自行設(shè)計(jì)的ptAsQ-F特異性引物建立了對馬鈴薯早疫病菌進(jìn)行分子檢

2、測的低成本、快捷和高靈敏度的半巢式PCR方法。利用引物ptAsQ-F/ptAs-R可從茄鏈格孢中獲得251 bp的特異性條帶，而其它相關(guān)鏈格孢種和馬鈴薯主要真細(xì)菌病害的病原菌均未擴(kuò)增出該條帶。以ptAs-F/ptAs-R為第一輪PCR引物，ptAsQ-F/ptAs-R為第二輪PCR引物建立半巢式PCR。該方法最低可以檢測10fg馬鈴薯早疫病菌基因組DNA，相當(dāng)于百分之一個(gè)分生孢子基因組含量;可對0.5g土壤含有1個(gè)分生孢子的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確

3、檢測。使用半巢式PCR檢測方法對河北圍場三個(gè)田間土樣進(jìn)行了檢測，其早疫病菌的檢出率分別為60％、60％和80％。
　　2.以ptAsQ-F/ptAs-R為引物建立了SYBR GreenⅠ熒光定量檢測技術(shù)。以含251bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性質(zhì)粒為參考，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對該曲線的特異性、可重復(fù)性、敏感性進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測范圍在1×106-6.4×101copies/μL之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.99

4、2，擴(kuò)增效率E=94.4％，組內(nèi)變異系數(shù)為0.11％-1.15％，組間變異系數(shù)為1.08％-2.51％，靈敏度比常規(guī)PCR方法高625倍。
　　3.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)對室內(nèi)接種早疫病菌的馬鈴薯葉片、模擬土壤樣品和田間土壤樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，感病品種隨著時(shí)間增長，菌量增加幅度較大，接種3天后的含菌量是第1天的49倍，而抗病品種在接種3天內(nèi)葉片中菌量變化不大。模擬土壤樣品中的茄鏈格孢分生孢子個(gè)數(shù)與Ct值呈線性關(guān)系，回歸