COLD-PCR用于混合檢材中微量等位基因富集的可行性.pdf

1、背景：來(lái)自兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體的混合檢材是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中經(jīng)常遇到的疑難檢材類型之一。隨著高靈敏檢測(cè)技術(shù)、高多態(tài)性和性連鎖等特殊遺傳標(biāo)記的普及應(yīng)用，從混合檢材中獲取證據(jù)信息的能力不斷提高。但即使對(duì)于經(jīng)驗(yàn)豐富的專家來(lái)說(shuō)，實(shí)際案件中一些混合檢材的檢測(cè)和結(jié)果解釋仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。如何對(duì)組份含量差異較大的混合檢材中的少量成份進(jìn)行分型，是當(dāng)前法醫(yī) DNA分析的難題之一。
　　目的：建立人類 Y染色體 M175插入/缺失基因座的 COLD-P

2、CR(co-ampLification atlower denaturation temperature PCR)技術(shù)，比較COLD-PCR與常規(guī)PCR對(duì)不同比例混合樣品的擴(kuò)增分型效果，初步探討COLD-PCR用于法醫(yī)混合檢材中低水平等位基因富集擴(kuò)增分型的可行性。
　　方法：首先建立人 Y-M175基因座的常規(guī) PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PCR-PAGE）銀染法分型技術(shù)，調(diào)查103名河南漢族男性無(wú)關(guān)志愿者的基因型。用蛋白酶 K消

3、化-酚/氯仿法提取插入和缺失型個(gè)體的基因組 DNA，按不同比例混合制備成混合樣品。用梯度保溫異源雙鏈消減法測(cè)定 M175大擴(kuò)增子(171/166bp)的臨界變性溫度（criticaldenaturation temperature，Tc），高分辨率熔解率曲線法（high resolution melting analysis，HRM）測(cè)定M175短擴(kuò)增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值為基礎(chǔ)，通過(guò)在常規(guī)PCR的變性和退火之間增加擴(kuò)增

4、產(chǎn)物雜交和異源雙鏈變性兩個(gè)步驟，分別建立和優(yōu)化基于 PAGE-銀染法（大擴(kuò)增子）和實(shí)時(shí)定量法（小擴(kuò)增子）的 COLD-PCR技術(shù)，比較常規(guī) PCR和 COLD-PCR對(duì)不同比例混合樣品的擴(kuò)增分型效果。
　　結(jié)果：河南漢族 Y-M175基因座插入和缺失型的頻率分別為0.1650、0.8350。M175大擴(kuò)增子的 Tc值為76.4℃，小擴(kuò)增子的 Tc值為78.4℃，優(yōu)化后采用的COLD-PCR異源雙鏈變性溫度分別為76.4和78.2℃