等位基因特異性PCR檢測HBV P基因區(qū)YMDD變異.pdf

1、目的:建立一種快速、敏感、經(jīng)濟(jì)的方法用于檢測HBV YMDD變異,該研究采用等位基因特異性PCR檢測HBV YMDD變異.方法:采用慢性乙型肝炎患者血清,通過相應(yīng)引物(P<,1>、P<,2>)擴(kuò)增PreS<,1>PreS<,2>S基因并分離純化,將分離純化的PreS<,1>PreS<,2>S基因與PUCm-TVector連接,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,獲得包括YMDD位點(diǎn)的基因序列,再通過PCR定點(diǎn)突變獲得YIDD和YVDD的標(biāo)

2、準(zhǔn)品作為陽性對照.設(shè)計(jì)一對引物(P<,3>、P<,4>)用于擴(kuò)增包括YMDD在內(nèi)約200bp的基因片段,此外設(shè)計(jì)三條型特異性引物分別用于識(shí)別YMDD、YIDD和YVDD,通過凝膠電泳判讀結(jié)果.檢出突變最后通過測序進(jìn)行確認(rèn).結(jié)果:該方法成功地克隆了YMDD、YIDD和YVDD標(biāo)準(zhǔn)品.采用所設(shè)計(jì)的引物對拉米夫定治療9月的45例慢性乙肝患者血清進(jìn)行YMDD變異的檢測,結(jié)果檢測到3例為變異株,1例為YVDD變異,另2例為混合感染(YMDD-YI