一種新的HBV耐藥突變的檢測方法：高靈敏COLD-PCR法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因突變是導(dǎo)致病毒耐藥的基礎(chǔ)，雖然測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于HBV耐藥突變檢測，但其較低的靈敏度大大限制了其臨床應(yīng)用價值；反向雜交的靈敏度較高，約為5％，但其價格較貴，操作不夠簡便，尤其在發(fā)展中國家無法全面推廣；一些新的技術(shù)，如質(zhì)譜分析、超深度測序和高通量測序等技術(shù)逐漸得以應(yīng)用，但是這些技術(shù)存在價格昂貴、操作繁瑣、數(shù)據(jù)分析工作量大、存在堿基錯配等缺點，較適合于研究目

2、的，不太適合于臨床應(yīng)用。為了克服以上方法的缺點，建立高靈敏度、簡便、價廉和實用的HBV耐藥突變檢測方法，本研究建立了低變性溫度共擴(kuò)增PCR(coamplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction, COLD-PCR)法并聯(lián)合Sanger測序技術(shù)，將其應(yīng)用于HBV已知和未知的耐藥突變檢測。
　　方法:
　　1.根據(jù)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(

3、reverse transcriptase,rt)的常見突變位點，設(shè)計可同時擴(kuò)增野生株和突變株HBV rt180～rt215序列的引物，通過改變PCR條件(主要是變性溫度)，確定產(chǎn)物關(guān)鍵變性溫度(critical denaturation temperature,Tc)，以富集突變株。
　　2.建立以Tc作為變性溫度的Fast COLD-PCR及Full COLD-PCR(比前者增加了雜交過程，可富集所有的突變類型)/Sanger

4、測序法，與常規(guī)PCR/Sanger測序法相比較，確定兩種方法檢測突變株的靈敏度、最低檢出限及特異性。
　　3.采用上述方法分別檢測30例發(fā)生長期服用抗病毒核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)，并且發(fā)生病毒學(xué)突破的慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者的HBV基因突變，比較其突變株類型及其檢出率。
　　結(jié)果:
　　1.常規(guī)PCR/Sanger測序?qū)λ蓄愋?/p>

5、突變株的檢出靈敏度均為10％(突變型:野生型比例為1:10，下同)。對于單一位點的突變類型，當(dāng)發(fā)生熔解溫度(melting temperature,Tm)下降的突變(如C:G→T:A等)時，F(xiàn)ast COLD-PCR對突變株的檢出靈敏度達(dá)1%，F(xiàn)ull COLD-PCR則為2%；對Tm不變或升高的突變(如C:G→G:C或T:A→C:G等)，僅有Full COLD-PCR可提高對突變株的靈敏度為2%。對于多位點突變類型，F(xiàn)ast COLD

6、-PCR與Full COLD-PCR法檢出突變的靈敏度可進(jìn)一步提高為0.5%和1%。
　　2.Fast COLD-PCR/Sanger測序法對不同突變類型的檢測濃度有所不同，對突變株 DNA的最低檢出限可從5.0E+01IU/ml~1.0E+03IU/ml不等；Full COLD-PCR/Sanger測序法對單一突變類型的檢測濃度大致相同，突變DNA濃度約≥5.0E+02IU/ml時即可檢出，對混合突變類型時最低檢出限可提高至1.

7、0E+02IU/ml。
　　3.30例CHB患者常規(guī)PCR/Sanger測序法均未檢出HBV基因突變；COLD-PCR/Sanger測序法共檢出混合突變21例，其中Fast COLD-PCR/Sanger測序法檢出17例突變(5例rtA181T+rtM204I，3例rtA181T，3例rtM204I，2例rtV191I，2例rtH197H，1例rtQ182Q+rtV191I，1例rtM204I+rtK212K)，F(xiàn)ull COLD

8、-PCR/Sanger測序法檢出14例突變(4例rtM204I，2例rtV191I，1例rtA181T，1例rtH197H，2例rtS189S+rtM204I，1例rtA181T+rtM204I，1例rtA180T+ rtM204V，1例rtQ182Q+rtV191I，1例rtS213S）。
　　結(jié)論:
　　聯(lián)合Fast/Full COLD-PCR與Sanger測序技術(shù)，能夠顯著提高大量野生型HBV DNA背景中的少量突變型