一種高通量定量檢測細胞凋亡方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是目前生物技術(shù)制藥產(chǎn)業(yè)廣泛采用的技術(shù)平臺,細胞凋亡的發(fā)生是培養(yǎng)中限制產(chǎn)量和增加成本的主要環(huán)節(jié),預(yù)防并控制凋亡也因此成為研究的熱點.進行凋亡控制的重要前提是對其進行早期檢測.該研究以雜交瘤細胞G7為研究對象,用DNA交聯(lián)染料YO-PRO-1(簡稱YP)聯(lián)合PI對細胞進行染色,活細胞、凋亡細胞和壞死細胞因膜通誘性的差異而著染為不同的顏色,從而將三者區(qū)分開來.分別借助熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測YP/PI染色的細胞凋亡情況

2、,將其檢測結(jié)果與公認較為準(zhǔn)確的AV/PI流式細胞儀方法進行比較,表明前兩者與后者有顯著的相關(guān)性,并且沒有顯著差異,因此可以用YP/PI染色的方法代替AV/PI流式法檢測細胞凋亡.在此基礎(chǔ)上,證明實了經(jīng)染色的細胞YP/PI熒光強度與凋亡/壞死細胞數(shù)具有顯著的相關(guān)性,因而可以通過檢測YP/PI熒光強度定量凋亡/壞死細胞數(shù).該研究優(yōu)化了熒光分光光度計檢測所需的各種條件,在96孔細胞培養(yǎng)板中,使用3μMYP,4μg/ml PI,于37℃孵育8m

3、in,用Ex/Em為485/538和530/590兩組濾光片分別檢測YP和PI的熒光強度.結(jié)合細胞密度的計數(shù)結(jié)果(細胞計數(shù)板、MTT比色法等),建立了用YP、PI熒光強度值計算細胞凋亡和壞死百分數(shù)的方法.實驗證實,該方法可檢測出樣品中少至100個的凋亡細胞,具有很高的靈敏度;檢測在96孔板中即可進行,操作簡便,快速省時,因而適于高通量應(yīng)用.將該方法應(yīng)用于尋找培養(yǎng)體系中的誘導(dǎo)細胞凋亡的主要因素和篩選有效的抗凋亡藥物方面,結(jié)果證明培養(yǎng)體系中

4、葡萄糖、胱氨酸、谷氨酰胺等營養(yǎng)成分的缺乏,pH降低等因素能夠誘導(dǎo)G7細胞發(fā)生凋亡.通過篩選幾種化學(xué)藥物,證實了在無gln和無葡萄糖兩種情況下,caspases抑制劑Z-VAD-FMK均能夠有效的抑制細胞凋亡的發(fā)生,是一種有應(yīng)用前景的抗凋亡藥物.用低劑量的Staurosporine處理半貼壁培養(yǎng)、呈球形的G7細胞,在不明顯影響細胞活力的條件下,可引起細胞發(fā)生伸展變形,成為類似成纖維細胞的形狀.檢測了該現(xiàn)象所伴隨的細胞生長代謝及細胞周期分布