建立一種快速檢測NF-κB活性的酶標方法.pdf

1、本實驗從人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞中提取總RNA，通過RT-PCR方法得到人NF-κB P50全長基因(長1308bp，編碼436個氨基酸)；構(gòu)建了重組表達載體pGEX-4T-P50；轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，在30℃，IPTG終濃度為0.2mM，誘導(dǎo)6hr，獲得融合蛋白GST-P50(分子量約70kD)，表達量占菌體總蛋白的30％，可溶性融合蛋白為總?cè)诤系鞍椎?/5；純化融合蛋白并免疫家兔獲得了多克隆抗體，抗體經(jīng)純化并分裝保存；Western印跡

2、分析表明純化后的多克隆抗體中已經(jīng)無針對GST蛋白的抗體，而只具有較強的專一于P50蛋白的抗體；ELISA分析證實其效價為5×105。 本實驗構(gòu)建的酶標檢測方法，經(jīng)過摸索并確定了：GST-P50包被濃度為1μg/ml、包被體積為100μl，抗體的稀釋度為1/1600，抗體與核蛋白樣品的溫育條件為37℃1hr，此時檢測NF-κB活性的靈敏度最高，可達到ng級，足以檢測出細胞中NF-κB活性的微量變化。 進一步利用檢測模型來驗

3、證此酶標方法的優(yōu)劣，實驗組加入了100ng/mlLPS刺激U251細胞30min，細胞中NF-κB的活性就顯著增高，1hr達到峰值，然后開始下降，6hr已經(jīng)處于低水平的維持狀態(tài)；當刺激時間同樣維持在1hr，LPS的濃度分別為10ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml、100 ng/ml時，細胞中NF-κB的活性隨劑量的增加而增高，用我們的酶標方法得到的檢測結(jié)果(細胞內(nèi)NF-κB活性變化趨勢)與Wang X的報道