一種新型水蛭纖溶酶的活性和機(jī)制研究.pdf

1、血栓性疾病是威脅人類健康的重大疾病。溶栓治療是血栓性疾病的主要治療手段，臨床上常使用的組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)及其變異體在使用過程中存在諸多不良反應(yīng)。因此，近期人們致力于從多種天然材料中得到新型的可用于溶栓治療的物質(zhì)。中藥的應(yīng)用亦得到重視，如水蛭。水蛭是一味傳統(tǒng)中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其有“逐惡血、淤血”“破血瘕積聚”的功效?，F(xiàn)代中醫(yī)使用單味水蛭或復(fù)方，用其煎劑、膠囊劑、片劑、丸劑、口服液等多種劑型，通過內(nèi)服外敷和局部注射等多種

2、途徑給藥廣泛治療不同系統(tǒng)、病位的血瘀癥。自20世紀(jì)50年代水蛭素被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外的科學(xué)工作者已經(jīng)從不同品種的水蛭中提取得到多種可用于治療血栓性疾病的蛋白質(zhì)或多肽，如凝血酶抑制劑、凝血因子抑制劑、血小板糖蛋白抑制劑、膠原蛋白介導(dǎo)的血小板聚集抑制劑和抗血栓蛋白等。本論文以中藥水蛭寬體金線蛭的干燥全體為試驗(yàn)材料，以實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)的新型水蛭纖溶酶為研究對象，對新型水蛭纖溶酶的溶栓活性、酶學(xué)性質(zhì)、作用機(jī)理進(jìn)行初步研究，為開發(fā)水蛭纖溶酶為新型

3、溶栓藥物奠定理論基礎(chǔ)。論文主要內(nèi)容如下。
　　1.水蛭纖溶酶的分離純化:試驗(yàn)采用酶解法、醇沉法對水蛭干品進(jìn)行處理得到蛋白粗提物，粗提物經(jīng)Q Sephrose Fast Flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠過濾層析純化得到水蛭纖溶酶。并對提取時(shí)采用的酶解法的合理性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.水蛭纖溶酶的活性測定及水蛭纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)測定:試驗(yàn)采用偶氮酪蛋白法對水蛭纖溶酶的酶活力進(jìn)行檢測，經(jīng)檢測，水蛭纖溶酶有纖溶活性

4、，水蛭纖溶酶的酶活為400U/mg。試驗(yàn)還對水蛭纖溶酶的最適溫度和pH值;溫度穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性以及金屬離子對酶活力的影響進(jìn)行測定。經(jīng)檢測，水蛭纖溶酶的最適溫度為55℃，當(dāng)溫度超過60℃時(shí)酶活力損失較大;最適pH為8.5，當(dāng)pH超過9時(shí)酶活力損失較大;200mM Na+，400mM Zn2+，200mM Mg2+和200mM K+對水蛭纖溶酶的酶活力有促進(jìn)作用，而200mM Mn2+，400mM Ca2+和200mM Zn2+有抑制水

5、蛭纖溶酶酶活力的作用;水蛭纖溶酶在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較高，該酶在pH7-pH9之間保持1h后，可保留50％以上的酶活力，在80℃保溫1h仍可保留50％的酶活力;
　　3.水蛭纖溶酶的體外溶栓活性測定:大鼠斷頭取血，在試管中形成血塊，檢測水蛭纖溶酶對血塊的降解情況。試驗(yàn)表明，水蛭纖溶酶具有較高的溶栓活性，對形成時(shí)間在12h內(nèi)的血栓都有降解作用且其溶栓活性與酶濃度相關(guān)。
　　4.水蛭纖溶酶作用機(jī)制的初步探究:本課題檢測了水蛭纖溶酶