具纖溶活性芽孢桿菌的研究.pdf

1、本文主要對具有纖溶活性的芽孢桿菌進行了研究，獲得的菌株其代謝產(chǎn)物——纖溶酶具有溶解血栓的主要成分(纖維蛋白)的特性，該菌株是從傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品中分離、篩選得到的，這為深入研究、開發(fā)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的功能性具有十分重要的意義。 本課題主要對以下幾方面進行了研究：(1)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的功能性。傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品如豆豉、豆瓣醬、腐乳等通常作為食品被人們利用。本文以傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品豆豉、腐乳、豆瓣醬、納豆等為菌源篩選材料得到產(chǎn)纖溶酶的菌株，確保了菌

2、源的安全性，并且開拓了利用傳統(tǒng)發(fā)酵食品的新途徑——功能性食品。 (2)篩選方法的確定。本課題為了確定適合的篩選產(chǎn)纖溶酶能力高菌株的方法，對比了不同菌株在酪蛋白平板和血纖維蛋白平板上的溶解圈趨勢，結(jié)果表明兩種篩選方法具有正相關(guān)性。從而確定采用酪蛋白平板代替血纖維蛋白平板作為初篩方法，具有快速、簡便、經(jīng)濟的特點。同時本試驗也對傳統(tǒng)的血纖維蛋白平板進行了改良，利用哺乳動物血液系統(tǒng)與人類血液系統(tǒng)具有相似性的原理采用無菌綿羊血制成模擬血栓

3、來對菌株進行復篩，建立了準確的復篩方法。 (3)篩選產(chǎn)纖溶酶能力高的菌株。試驗采用酪蛋白平板初篩與血纖維蛋白平板復篩相結(jié)合的方法，以國內(nèi)外大豆發(fā)酵食品為菌源篩選材料，從中共分離出64株產(chǎn)纖溶酶的菌株，經(jīng)過初篩得到8株產(chǎn)纖溶酶活力高的菌株，通過對初篩菌株的進一步復篩得到2株產(chǎn)纖溶酶活力最高的菌株YL-P2、YL-F2，酶活力分別達到了1122IU/mL和1137IU/mL。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化等特征確定YL-P2

4、、YL-F2為枯草芽孢桿菌。 (4)對所篩選的菌株進行物理及化學誘變提高菌株產(chǎn)纖溶酶的能力。以枯草芽孢桿菌YL-P2、YL-F2作為出發(fā)菌株，分別采用紫外線(UV)誘變、硫酸二乙酯誘變、以及紫外線和硫酸二乙酯復合誘變，以酪蛋白平板法為初篩方法結(jié)合纖維蛋白平板復篩的方法選育纖溶酶活力高的菌株，獲得了高產(chǎn)纖溶酶突變株UV-8。UV-8纖溶酶活力達到2314IU/mL，與出發(fā)菌株相比酶活力提高了2倍。經(jīng)10次傳代后菌株UV-8的纖溶酶

5、酶活力達到穩(wěn)定。 (5)對突變株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，產(chǎn)酶量達到最大。突變株UV-8在不同的發(fā)酵條件(溫度、接種量、起始pH值、裝液量)和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(碳源、氮源、金屬離子、表面活性劑)等單因子試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合正交實驗得到該菌株的最適宜的液體發(fā)酵條件為：可溶性淀粉3％，酵母膏3％，吐溫600.25％，復合金屬離子0.2％，pH7.0，發(fā)酵溫度35℃，裝液量為50mL/250mL，4％接種量。 (6)對突變株UV-8代謝產(chǎn)

6、物的活性進行了初步研究。通過測定含有不同成分的纖維蛋白平板確定纖溶酶的纖溶方式，測定發(fā)酵液和細胞提取液的纖溶酶活力判斷菌株產(chǎn)纖溶酶為胞外酶還是胞內(nèi)酶，通過加入不同飽和度的硫酸銨確定純化纖溶酶的最適硫酸銨飽和度，同時測定了菌株代謝產(chǎn)物的體外溶栓性能、抑菌等特性。結(jié)果表明UV-8代謝產(chǎn)物只有直接溶解纖維蛋白的功能而不能激活纖溶酶原發(fā)揮間接溶解血栓的作用。確定纖溶酶的硫酸銨沉淀點應該選在50％。纖溶酶對血凝塊的作用在12h和24h的溶解率分別