內(nèi)生多粘芽孢桿菌纖溶酶的純化、性質(zhì)及其基因的克隆與表達(dá).pdf

1、血栓栓塞性疾病嚴(yán)重危害人類健康和生命，溶栓療法是治療血栓栓塞性疾病最為有效并且可靠的手段。目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物療效肯定，明顯降低了患者的死亡率和致殘率，但還存在特異性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺點(diǎn)。因此迫切需要研制開發(fā)高效、特異、安全、副作用小、價(jià)廉的新型溶栓藥物。已有研究表明，許多中藥具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，包括生物堿類、黃酮類以及皂甙等化合物，尤其是活血化瘀中草藥具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用。

2、生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌，由于內(nèi)生菌與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，使內(nèi)生菌具有產(chǎn)生某些與植物相同或相似化合物的能力。鑒于此，從中藥植物內(nèi)生菌資源中可尋找和發(fā)現(xiàn)一些新型的溶栓藥物。
　　 本研究首次在內(nèi)生細(xì)菌中篩選分離到一株具有纖溶活性較高和良好體外溶栓效果的EJS-3菌株，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)特征、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)內(nèi)生多粘芽孢桿菌纖溶酶的分離純化及其性質(zhì)進(jìn)行深入的研究。同時(shí)，采用基因工程技術(shù)

3、將內(nèi)生多粘芽孢桿菌纖溶酶基因克隆到表達(dá)載體上，實(shí)現(xiàn)內(nèi)生多粘芽孢桿菌纖溶酶異源表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的提純和重組酶的酶學(xué)性質(zhì)作了初步探討，為研制和開發(fā)新型的溶栓藥物提供重要理論依據(jù)。主要研究結(jié)果分述如下：
　　 1.采用酪蛋白平板和纖維蛋白平板初篩、搖瓶復(fù)篩的篩選策略，從金銀花、黃芩、蒲公英、黃連、連翹、爬山虎、魚腥草、百部等植物的根、莖、葉分離篩選到7株具有纖溶活性的內(nèi)生菌。其中從百部中分離到的內(nèi)生菌株EJS-3酶活最高，達(dá)110

4、IU/mL。通過對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特征進(jìn)行鑒定，初步判斷該菌株為多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。對(duì)菌株EJS-3的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)得到的1500bpPCR產(chǎn)物純化和序列測定，利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索，并構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：菌株EJS-3的16S rDNA序列(DQ120522)與多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的16S rDNA序列的

5、同源性均達(dá)98％以上，親緣關(guān)系最近。結(jié)合常規(guī)的形態(tài)特征、生理生化特征鑒定，表明該菌株在細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)上屬于多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。目前，國內(nèi)外內(nèi)生多粘芽孢桿菌產(chǎn)纖溶酶的研究尚未見報(bào)道。
　　 2.內(nèi)生菌株EJS-3發(fā)酵液經(jīng)離心除菌，硫酸銨分級(jí)沉淀，Hiprep phenyl FF疏水層析，RESOURCEMQ離子交換層析和Sephacryl S-300HR凝膠過濾，獲得電泳純的多粘芽孢桿菌纖

6、溶酶(PPFE-D， HPLC為單一峰，純度為94.1％。每升發(fā)酵液中可獲得1.6 mg活性蛋白，每毫克蛋白活力達(dá)2096 IU，純度提高了14.5，回收率為3.3％。
　　 3， SDS-PAGE測定PPFE-I的相對(duì)分子質(zhì)量為63 KDa， MALDI-TOF質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定其相對(duì)分子質(zhì)量為63.3 KDa。該酶最適反應(yīng)溫度37℃，最適反應(yīng)pH7.5，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性.金屬離子Cu2+和Ca2+能抑制其纖溶活性，

7、Mg2+，F(xiàn)e2+和2n2+對(duì)該酶存在明顯的激活作用。1 mmol/L PMSF完全抑制其纖溶活性，EDTA能部分抑制纖溶活性，這表明PPFE-I屬于絲氨酸蛋白酶，此酶還可能是一種金屬蛋白酶。
　　 4.利用幾種人工合成的底物測定水解酰胺鍵活性的高低。結(jié)果表明，PPFE-I的最適底物是枯草桿菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最適底物，即N-Succinyl-Ala-Ala-ProPhe-pNA;水解生色底物N-Succinyl-Ala-A

8、la-Pro-Phe-pNA的米氏常數(shù)Km為0.20 mM,表明PPFE-I對(duì)該底物有較好的親和性；PPFE-I在普通纖維蛋白平板和加熱平板上測定的纖溶活性沒有顯著的差別，這表明PPFE-I對(duì)纖維蛋白具有直接的降解作用，不具有激活纖溶酶原形成纖溶酶的活性，因而PPFE-I是一種纖溶酶，而不是纖溶酶原激活劑：通過PPFE-I對(duì)人血纖維蛋白原的體外降解過程的研究，結(jié)果表明纖溶酶PPFE-I最先降解α鏈，其次是β鏈，而對(duì)丫鏈降解最緩慢，1-4

9、 h逐漸降解至完全；通過體外血凝塊的溶解作用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)PPFE-I酶溶液對(duì)血凝塊作用24h時(shí)，其對(duì)體外血凝塊的溶解率91.33％，表明PPFE-I有明顯的體外溶栓作用，直接溶解作用的結(jié)果，同時(shí)具有顯著的抗凝活性，并且抗凝血效果優(yōu)于尿激酶。
　　 5.為了實(shí)現(xiàn)內(nèi)生多粘芽孢桿菌纖溶酶的異源高效表達(dá)，以內(nèi)生菌株EJS-3基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR擴(kuò)增PPFE-I基因，并克隆到pMD-19T載體上，構(gòu)建克隆載體pMD-PPFE

10、-I，經(jīng)測序正確后，將PPFE-I克隆至表達(dá)載體pET-DsbA上，成功構(gòu)建了pET-DsbA/PPFE-I重組表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化Ecoli BL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物酶活性達(dá)228 IU/mL。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白主要以可溶形式表達(dá)，占菌體總蛋白的18.4％。 Western blot結(jié)果表明在相應(yīng)

11、分子量處有一條特異性條帶，證實(shí)該蛋白為DsbA-PPFE-I融合蛋白。
　　 6。表達(dá)產(chǎn)物通過Ni親和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步驟進(jìn)行分離純化，并用MALDI-TOF質(zhì)譜對(duì)重組酶進(jìn)行了鑒定。純化后的表達(dá)產(chǎn)物在纖維蛋白平板上表現(xiàn)出明顯的纖溶活性。對(duì)純化的重組纖溶酶進(jìn)行最適溫度及其穩(wěn)定性、最適pH及其穩(wěn)定性以及蛋白酶抑制劑、金屬離子的影響等性質(zhì)的研究，結(jié)果表明，重組酶與天然纖溶酶是一致的.
　　 7.為