多粘類芽孢桿菌極端嗜熱多肽的純化、基因克隆及其對稻瘟病的防治研究.pdf

1、水稻稻瘟病(Magnaporthe grisea)是全球水稻種植區(qū)危害最為嚴(yán)重的病害之一，又名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等。該病一年四季均可對水稻造成危害，其危害遍及水稻的各個(gè)部位，一般造成水稻減產(chǎn)10％～20％。目前，水稻抗瘟性品種的利用和化學(xué)農(nóng)藥的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但由于抗瘟品種的單一化、稻瘟病菌生理小種遺傳的復(fù)雜性和致病性的多樣性以及化學(xué)農(nóng)藥的毒性和病原菌的抗藥性等原因，水稻抗瘟性品種和化學(xué)農(nóng)藥使用在生產(chǎn)上

2、都受到一定的限制。為此，水稻稻瘟病的生物防治，特別是生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)，是水稻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的需要。嗜熱蛋白是一類主要來源于嗜熱微生物的熱穩(wěn)定蛋白，能夠在高溫下長時(shí)間保持活性而不變性。迄今為止，對嗜熱蛋白的穩(wěn)定機(jī)理從實(shí)驗(yàn)和理論等方面都進(jìn)行了探討，提出了各種不同的機(jī)制，目前已報(bào)道了多種不同的解釋嗜熱蛋白熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的物理和化學(xué)因素，但并未發(fā)現(xiàn)常溫細(xì)菌產(chǎn)生極端嗜熱蛋白的報(bào)道，而多粘菌類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa

3、)對稻瘟病菌的拮抗機(jī)理仍不清楚。本文對拮抗菌多粘類芽孢桿菌LM-3菌株進(jìn)行了蛋白純化、基因克隆及其對稻瘟病的防治研究，旨在為生物農(nóng)藥的研發(fā)、抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因育種以及為深入研究常溫菌產(chǎn)生極端嗜熱蛋白及其對稻瘟病菌拮抗機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果歸納如下： 1、拮抗菌LM-3發(fā)酵產(chǎn)物拮抗物質(zhì)的純化。本試驗(yàn)用加熱法(85～90℃)從多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LM-3菌株的發(fā)酵液中純化得到2個(gè)極端嗜

4、熱多肽。稻瘟病菌平板拮抗實(shí)驗(yàn)表明，5μl純化多肽對稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)抑菌率達(dá)89.6％。SDS-PAGE電泳顯示純化多肽分子量介于6 000～7 000 Da之間。多肽復(fù)性后，其中之一對稻瘟病菌表現(xiàn)出強(qiáng)的拮抗活性，命名為APPLM3(Antagonism Polypeptide from Paenibacillus pof)，myxa LM-3)；另一個(gè)則無此活性，命名為PPLM3(Polypeptide f

5、rom Paenibacillus polymyxa LM-3)。 2、拮抗多肽的N．末端氨基酸測序及序列比對分析。采用Edman降解法對APPLM3進(jìn)行氨基酸測序，獲得了其N-末端5個(gè)氨基酸序列(H<,2>N-ANDPR)；以該序列為靶序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上進(jìn)行相似性檢索，發(fā)現(xiàn)其可能與來源于Burkholderia的3個(gè)假設(shè)蛋白(或推導(dǎo)蛋白

6、)相關(guān)。 3、拮抗多肽熱穩(wěn)定性檢測。純化多肽分別在60℃、80℃、100℃下處理60 min，在120℃下分別處理20 min、40 min、60 min，并以4℃純化多肽為對照。以上述7個(gè)處理對稻瘟病菌的拮抗活性進(jìn)行了熱穩(wěn)定性檢測，結(jié)果表明，拮抗多肽經(jīng)60℃、80℃處理60 min后其活性并沒有顯著降低，100℃處理60 min后活性有所降低，但仍保持在90％以上；當(dāng)溫度增至120℃、處理20 min后拮抗多肽仍然保持了85.

7、4％的活性。處理時(shí)間延長多肽拮抗活性降低，處理溫度超過100℃后，多肽拮抗活性降低速度隨加熱時(shí)間和溫度增加而加快，120℃處理60 min后多肽拮抗活性完全喪失。試驗(yàn)證明，純化多肽對稻瘟病菌的拮抗活性的熱穩(wěn)定性相當(dāng)高。 4、拮抗多肽的基因克隆。提取LM-3基因組DNA，用Sau3AI進(jìn)行不完全酶切，回收500～4000 bp的片斷，將其插入pUCl9的BamHI位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌中，用α-互補(bǔ)法篩選陽性克隆。從所得的

8、約7 200個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子中在PDA/LB平板上進(jìn)一步選擇拮抗轉(zhuǎn)化子，但由于篩選溫度不易控制、目的片斷過短等原因，導(dǎo)致了克隆試驗(yàn)的失敗。 5、以拮抗多肽為主成分的乳劑的制備及其對苗瘟的田間防效。為測定拮抗多肽APPLM3的田間表現(xiàn)，將LM-3發(fā)酵液與甲醇溶劑、復(fù)合型乳化劑(乳化劑OP及土溫80)組配成5種微生物源乳劑。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)對照，以CK<,1>和CK<,2>的加權(quán)病指作為參比，CK<,3>為農(nóng)藥對照，較好消除了試驗(yàn)誤差，提高