多粘類芽孢桿菌極端嗜熱多肽的純化、基因克隆及其對稻瘟病的防治研究.pdf

1、水稻稻瘟病(Magnaporthe grisea)是全球水稻種植區(qū)危害最為嚴重的病害之一，又名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等。該病一年四季均可對水稻造成危害，其危害遍及水稻的各個部位，一般造成水稻減產10％～20％。目前，水稻抗瘟性品種的利用和化學農藥的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但由于抗瘟品種的單一化、稻瘟病菌生理小種遺傳的復雜性和致病性的多樣性以及化學農藥的毒性和病原菌的抗藥性等原因，水稻抗瘟性品種和化學農藥使用在生產上

2、都受到一定的限制。為此，水稻稻瘟病的生物防治，特別是生物農藥的研究與開發(fā)，是水稻生產可持續(xù)發(fā)展的需要。嗜熱蛋白是一類主要來源于嗜熱微生物的熱穩(wěn)定蛋白，能夠在高溫下長時間保持活性而不變性。迄今為止，對嗜熱蛋白的穩(wěn)定機理從實驗和理論等方面都進行了探討，提出了各種不同的機制，目前已報道了多種不同的解釋嗜熱蛋白熱穩(wěn)定性增強的物理和化學因素，但并未發(fā)現常溫細菌產生極端嗜熱蛋白的報道，而多粘菌類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa

3、)對稻瘟病菌的拮抗機理仍不清楚。本文對拮抗菌多粘類芽孢桿菌LM-3菌株進行了蛋白純化、基因克隆及其對稻瘟病的防治研究，旨在為生物農藥的研發(fā)、抗稻瘟病轉基因育種以及為深入研究常溫菌產生極端嗜熱蛋白及其對稻瘟病菌拮抗機制的深入研究奠定基礎。試驗結果歸納如下： 1、拮抗菌LM-3發(fā)酵產物拮抗物質的純化。本試驗用加熱法(85～90℃)從多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LM-3菌株的發(fā)酵液中純化得到2個極端嗜

4、熱多肽。稻瘟病菌平板拮抗實驗表明，5μl純化多肽對稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)抑菌率達89.6％。SDS-PAGE電泳顯示純化多肽分子量介于6 000～7 000 Da之間。多肽復性后，其中之一對稻瘟病菌表現出強的拮抗活性，命名為APPLM3(Antagonism Polypeptide from Paenibacillus pof)，myxa LM-3)；另一個則無此活性，命名為PPLM3(Polypeptide f

5、rom Paenibacillus polymyxa LM-3)。 2、拮抗多肽的N．末端氨基酸測序及序列比對分析。采用Edman降解法對APPLM3進行氨基酸測序，獲得了其N-末端5個氨基酸序列(H<,2>N-ANDPR)；以該序列為靶序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上進行相似性檢索，發(fā)現其可能與來源于Burkholderia的3個假設蛋白(或推導蛋白

6、)相關。 3、拮抗多肽熱穩(wěn)定性檢測。純化多肽分別在60℃、80℃、100℃下處理60 min，在120℃下分別處理20 min、40 min、60 min，并以4℃純化多肽為對照。以上述7個處理對稻瘟病菌的拮抗活性進行了熱穩(wěn)定性檢測，結果表明，拮抗多肽經60℃、80℃處理60 min后其活性并沒有顯著降低，100℃處理60 min后活性有所降低，但仍保持在90％以上；當溫度增至120℃、處理20 min后拮抗多肽仍然保持了85.

7、4％的活性。處理時間延長多肽拮抗活性降低，處理溫度超過100℃后，多肽拮抗活性降低速度隨加熱時間和溫度增加而加快，120℃處理60 min后多肽拮抗活性完全喪失。試驗證明，純化多肽對稻瘟病菌的拮抗活性的熱穩(wěn)定性相當高。 4、拮抗多肽的基因克隆。提取LM-3基因組DNA，用Sau3AI進行不完全酶切，回收500～4000 bp的片斷，將其插入pUCl9的BamHI位點，并轉化至DH5a大腸桿菌中，用α-互補法篩選陽性克隆。從所得的

8、約7 200個陽性轉化子中在PDA/LB平板上進一步選擇拮抗轉化子，但由于篩選溫度不易控制、目的片斷過短等原因，導致了克隆試驗的失敗。 5、以拮抗多肽為主成分的乳劑的制備及其對苗瘟的田間防效。為測定拮抗多肽APPLM3的田間表現，將LM-3發(fā)酵液與甲醇溶劑、復合型乳化劑(乳化劑OP及土溫80)組配成5種微生物源乳劑。試驗共設3個對照，以CK<,1>和CK<,2>的加權病指作為參比，CK<,3>為農藥對照，較好消除了試驗誤差，提高