嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定糖化酶純化及其編碼基因的克隆與表達(dá).pdf

1、糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系統(tǒng)命名為淀粉α-1.4-葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)]，是一種具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷鍵，而得到終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1.6-葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，是淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過(guò)程中的主要酶類之一。糖化酶具有重要商業(yè)價(jià)值，凡對(duì)淀粉、糊精、低聚糖進(jìn)行酶水

2、解的工業(yè)上，都可適用。盡管糖化酶對(duì)α-1.6-糖苷鍵的活性只有α-1.4-糖苷鍵的0.2％，這足以在工業(yè)糖化過(guò)程中影響產(chǎn)量。這一特性及在其他方面的需求產(chǎn)生現(xiàn)在研究人員對(duì)糖化酶的目標(biāo)特定的蛋白質(zhì)工程研究。 目前國(guó)內(nèi)外已篩選出多種糖化酶生產(chǎn)菌，并將其分離提純。但市場(chǎng)應(yīng)用的糖化酶主要來(lái)源于常溫菌，因產(chǎn)品成本高，熱穩(wěn)定性差，儲(chǔ)存期短，酶活力和產(chǎn)率低而制約糖化酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)上的應(yīng)用。由此可見(jiàn)，熱穩(wěn)定性糖化酶的研究和開(kāi)發(fā)具有重要的商業(yè)價(jià)值。

3、 嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)是一種廣泛分布的，生長(zhǎng)上限溫度較高的嗜熱真菌，從該菌中已分離了多種嗜熱酶，但未見(jiàn)該菌嗜熱糖化酶的報(bào)道。本研究中C.thermophilum在以可溶性淀粉為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生了糖化酶，通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析、Phenyl-Sepharose疏水層析等步驟獲得了凝膠電泳均一的糖化酶。SDS-PAGE測(cè)得所分離純化酶

4、蛋白的分子量約為64kDa。 該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為65℃和4.0。在pH4.5條件下，該酶在50℃以下穩(wěn)定，70℃的半衰期為20min。Ca2+，Mg2+，Na+，K+對(duì)酶有激活作用，一些重金屬離子Fe2+，Ag+，Hg2+對(duì)酶有顯著的抑制作用。該糖化酶是一種糖蛋白，含糖量為11.7％。C.thermophilum熱穩(wěn)定糖化酶的N-端15個(gè)氨基酸序列為Ala-Val-Asp-Ser-Tyr-Ile-Glu-Arg-Gl

5、u-Thr-Pro-Ile-Ala-Trp-Asn，與Neurosporacrassa，Humicolagrisea和Thielaviaterrestris糖化酶的N-端氨基酸序列有較高的同源性。 根據(jù)C.thermophilum熱穩(wěn)定糖化酶的N-端氨基酸序列和同源保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了該糖化酶的編碼基因gla，全長(zhǎng)cDNA為2016bp，包含一個(gè)由599個(gè)氨基酸組

6、成的開(kāi)放閱讀框。該基因已在Genbank中注冊(cè)，登錄號(hào)為DQ104609。 由核苷酸序列推導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸序列N-端前30個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，完全去除信號(hào)肽后，N端氨基酸序列與測(cè)定的純酶N端序列完全一致。比較糖化酶的催化區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)與15家族糖化酶的同源性很高，在催化區(qū)中有五個(gè)基序P-YFY-W-RDAAL、WG-PQRDGP、D-WEEV、AVG-Y-ED和L-W-YA非常保守。這些保守基序與糖基水解酶(glycosylhyd

7、rolases)15家族催化活性有關(guān)。vgla基因和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K雙酶切后體外連接，構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/gla并測(cè)序，保證正確的閱讀框。將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/gla和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶SacⅠ(位于5'AOX1區(qū)內(nèi))線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)及G418抗性篩選多拷

8、貝整合子，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來(lái)篩選高效表達(dá)目的糖化酶的工程菌株。篩選到表達(dá)酶活性最高的菌株GS-GLA-22，甲醇誘導(dǎo)6d酶活性達(dá)到最高，達(dá)16.73U/mL，酶蛋白表達(dá)量為0.86mg/mL。檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量及遺傳穩(wěn)定性，并測(cè)定表達(dá)糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)。 酵母工程菌株GS-GLA-22在YPD平板上劃線，連續(xù)傳代10次后，PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，重組糖化酶的表達(dá)量基本保持穩(wěn)定。表達(dá)糖化酶GLA

9、的最適反應(yīng)溫度和pH分別為65℃和4.5～5.0，該酶在60℃以下穩(wěn)定；65℃的半衰期為40min；在pH值為2.5～7.0之間表達(dá)糖化酶保持穩(wěn)定的酶活性；Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+對(duì)酶有激活作用，一些重金屬離子Ag+、Hg2+對(duì)酶有顯著的抑制作用。 C.thermophilum糖化酶能在畢赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表達(dá)產(chǎn)物同樣具有原始菌株C.thermophilum糖化酶的優(yōu)良特性，這就預(yù)示了表達(dá)