單環(huán)刺螠纖溶酶分離純化、免疫原性及其基因克隆的初步研究.pdf

1、本研究旨在從海洋動(dòng)物單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)體內(nèi)提取純化出一種新型的生物溶栓劑，在此基礎(chǔ)上確定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部分編碼區(qū)cDNA，為進(jìn)一步開展基因工程菌的構(gòu)建，重組活性蛋白的表達(dá)的深入研究奠定基礎(chǔ)。 方法：將單環(huán)刺螠體腔液經(jīng)離心，經(jīng)分子量8,000Da和30kD截留分子量濾膜超濾、Sephadex G-75、DE52陰離子交換層析柱和Sephacryl S-100HR凝膠柱分離等步驟進(jìn)行酶的

2、分離純化。SDS-PAGE電泳和HPLC鑒定純度，測(cè)定其分子量。N端測(cè)序及質(zhì)譜從頭測(cè)序(de novo)確定該酶的部分氨基酸序列。 為研究單環(huán)刺螠纖溶酶作為一種潛在藥物，其對(duì)藥物安全性評(píng)價(jià)的影響和動(dòng)物體內(nèi)過敏反應(yīng)，對(duì)該纖溶酶進(jìn)行了初步免疫原性研究，以天然纖溶酶和加熱變性纖溶酶分別免疫新西蘭兔，采用背部皮下和后腿肌肉多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，瓊脂雙向擴(kuò)散法測(cè)定纖溶酶抗體效價(jià)。 采用RT-PCR的方法，根據(jù)N端及另外3段氨基酸序列設(shè)

3、計(jì)10條簡(jiǎn)并引物，組成18種組合，以單環(huán)刺螠消化道組織總RNA為模板，用RT-PCR的方法嘗試克隆該種纖溶酶組分的cDNA片段。 結(jié)果：通過酶的純化最終獲得一種純酶組分，在SDS-PAGE電泳圖譜上顯示一條蛋白區(qū)帶，經(jīng)HPLC鑒定呈現(xiàn)單一峰，說明為純品。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定為約26.4kDa。酶純化倍數(shù)為10.2，回收率為13.9％，比活力達(dá)421.9U/mg。 經(jīng)專一性水解酶降解，N端測(cè)序及質(zhì)譜分析，獲取酶分子中5段多肽鏈

4、的氨基酸序列，分別為：N端：ICGGSPADIT；中間部分序列：DMKR；RNRLPHACMPZR；ACVWYFVH；BNEGGYLDACM。經(jīng)Blastp比對(duì)分析，沒有發(fā)現(xiàn)同源性較高的序列，說明此酶為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。 瓊脂雙向擴(kuò)散平板未出現(xiàn)免疫沉淀線，表明該酶免疫原性低，在兔體內(nèi)未產(chǎn)生可檢測(cè)的抗體量。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中克隆得到了3個(gè)基因片段，經(jīng)Blastp搜索分析，其中2個(gè)片段與蚯蚓、白蟻等動(dòng)物來源的內(nèi)切葡聚糖酶相似

5、性較高，1個(gè)與septin基因家族成員septin11相似性較高。但設(shè)計(jì)引物所依據(jù)的氨基酸序列是根據(jù)質(zhì)譜圖推算出的，這種方法鑒定的可靠性有待進(jìn)一步確定?？赡苄枰俳Y(jié)合傳統(tǒng)化學(xué)方法進(jìn)行末端氨基酸序列測(cè)定，再分離基因。數(shù)據(jù)庫(kù)所給出的結(jié)果雖然顯示了一定的相似性，但尚不能確定獲得的序列與搜索到的基因是同一類基因，也有可能是一種全新的具有纖溶活力的蛋白質(zhì)。要最終證明其是否為纖維蛋白溶解酶，需要通過克隆全長(zhǎng)cDNA序列，在原核或真核生物中表達(dá)，獲得