單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）vasa基因及β-actin基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、vasa基因編碼DEAD-box家族成員中一種ATP依賴的RNA解旋酶，在果蠅中作為生殖質(zhì)的組成成份被首次報(bào)道。vasa基因可在許多后生動(dòng)物生殖系細(xì)胞中特異性的表達(dá)，因此被廣泛用作生殖細(xì)胞的分子標(biāo)記物，在動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)生和生殖調(diào)控等研究中起到了重要的作用。單環(huán)刺蜢(Urechis unicinctus)屬蜢蟲動(dòng)物門(Echiuroidea)，是我國黃渤海沿岸常見的刺蜢物種。本文采用同源克隆策略及SMART-RACE技術(shù)，篩選和克隆了單環(huán)

2、刺<蟲益>vasa基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)其組織分布及發(fā)育過程的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步研究單環(huán)刺<蟲益>原生殖細(xì)胞的起源、分化及其生殖調(diào)控奠定基礎(chǔ)。 本研究獲得的單環(huán)刺<蟲益>vasa基因的cDNA序列全長(zhǎng)4080bp，其中開放閱讀框ORF長(zhǎng)2322bp，可以編碼773個(gè)氨基酸的蛋白，5′UTR(Untranslated Reagion，非編碼區(qū))為322bp，3′UTR為1436bp。B

3、lastp分析表明由該cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與哺乳動(dòng)物、魚、兩棲類、昆蟲以及一些無脊椎動(dòng)物的VASA蛋白序列均具有較高的相似性；除具有DEAD-box家族蛋白共有的全部8個(gè)保守motif曉外，在其N端還具有RGG重復(fù)序列及甘氨酸富集區(qū)等vasa亞家族基因的專一性特征結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果也顯示由該cDNA推導(dǎo)的蛋白序列和其他物種的VASA相關(guān)蛋白聚成一支，其與VASA亞家族成員的進(jìn)化關(guān)系明顯近于PL10或是P68等其他DEAD

4、-box亞家族蛋白，表明獲得的為單環(huán)刺蜢的vasa基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并將其編碼的蛋白命名為UuVASA。采用半定量RT-PCR技術(shù)研究了單環(huán)刺蜢vasa mRNA在不同組織中的分布，發(fā)現(xiàn)在兩性生殖細(xì)胞中vasa基因均存在較高水平的表達(dá)，但在其他組織(非生殖期成體的體壁、中腸、呼吸腸、腎管及體腔液細(xì)胞)中則幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)信號(hào)，表明在單環(huán)刺蜢體內(nèi)，vasa基因同樣僅限制在生殖系細(xì)胞中表達(dá)，因此可以作為一個(gè)分子標(biāo)記來追蹤單環(huán)刺<蟲益

5、>PGCs的起源、遷移和分化；對(duì)其各個(gè)發(fā)育階段表達(dá)的RT-PCR結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞及受精卵中均存在vasa mRNA的表達(dá)信號(hào)，因此認(rèn)為單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）早期胚胎中vasa基因的表達(dá)是由母源性提供的；從受精卵至8-細(xì)胞期其表達(dá)呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，表明受精后啟動(dòng)了vasa的合子表達(dá)；囊胚期的表達(dá)有所減弱，到擔(dān)輪幼蟲期其表達(dá)量極其微弱，之后又逐漸增強(qiáng)，表明擔(dān)輪幼蟲之后vasa基因主要由合子表達(dá)提供，其表達(dá)趨勢(shì)與其他大多數(shù)物種的vas

6、a基因相類似。此外，選擇性拼接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)預(yù)期的拼接突變的條帶，因而初步推測(cè)單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）vasa基因不存在N末端選擇性拼接的情況。β-actin因其高度保守的特征及持續(xù)衡量表達(dá)的特點(diǎn)，常作為許多量化實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照，并且其氨基酸序列被廣泛用于構(gòu)建真核生物分子發(fā)生樹以反映物種間的進(jìn)化關(guān)系。本研究中獲得的單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin基因的eDNA序列全長(zhǎng)1527bp，其中開放閱讀框ORF長(zhǎng)1131bp，可編碼3

7、76個(gè)氨基酸；5＇UTR為82bp，3＇UTR為314bp。Blastp分析顯示由該cDNA推導(dǎo)的蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物、兩棲類、魚、昆蟲以及貽貝、海星等無脊椎動(dòng)物的I~-acfin蛋白序列存在很高的相似性，相似度均在95％以上，表明其在生物進(jìn)化過程中保持著高度的保守性；進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析也發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin與所有選擇物種的β-actin聚類，表明獲得的為單環(huán)刺（蟲益）（打不出來）β-actin基因的全長(zhǎng)eDNA