基于RAD測(cè)序技術(shù)的單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及5個(gè)地理群體遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)是一種在我國(guó)黃、渤海海區(qū)新興的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種，其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有極其巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但隨著過度捕撈以及環(huán)境破壞，單環(huán)刺螠資源已經(jīng)呈現(xiàn)衰退趨勢(shì)，單環(huán)刺螠?zhǔn)袌?chǎng)價(jià)格也不斷攀升。人工養(yǎng)殖以及有計(jì)劃的增殖放流迫在眉睫。雖然在山東地區(qū)人工育苗已經(jīng)有所突破，但其地理種群遺傳分析與遺傳結(jié)構(gòu)差異方面的研究還未曾報(bào)道，而發(fā)展的日趨成熟的微衛(wèi)星標(biāo)記輔助育種技術(shù)為水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的人工良種選育以及快速繁育工

2、作提供了可行而有效的工具。本研究基于RAD（restriction association site DNA）高通量測(cè)序法短時(shí)間獲得大量單環(huán)刺螠微衛(wèi)星序列，經(jīng)過層層篩選，最終開發(fā)出22對(duì)高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。進(jìn)而利用這些微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)黃渤海海區(qū)5個(gè)野生地理群體（山東省煙臺(tái)市YT、山東省濰坊市WF、山東省青島市QD、河北省秦皇島市QHD、遼寧省大連市DL）進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析和評(píng)估。
　　1.單環(huán)刺螠微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)
　　首先，

3、利用改良后的酚—氯仿—異戊醇抽提法提取高質(zhì)量的單環(huán)刺螠DNA，進(jìn)而進(jìn)行以Illumina HiSeq2500平臺(tái)的單環(huán)刺螠RAD文庫(kù)的構(gòu)建，再對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和統(tǒng)計(jì)分析，本次測(cè)序共產(chǎn)生Raw data2.113G，過濾后的Clean data2.109G，測(cè)序質(zhì)量情況為Q20>=96.76％、Q30>=92.22%，GC含量40.06%，而組裝后GC含量39.98%，兩者相差較小。從組裝后的序列片段中檢測(cè)到大量雜合單核苷酸多態(tài)性（SN

4、P）位點(diǎn)和少量的純合單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，雜合度約為96.5%，從以上結(jié)果基本可以認(rèn)為RAD測(cè)序的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　本次測(cè)序共檢測(cè)到SSR序列1287個(gè)，其中測(cè)得三核苷酸微衛(wèi)星為818個(gè)，數(shù)量最多，約占總數(shù)的63.56%。為微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度在18bp以上的序列設(shè)計(jì)引物，挑選微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度在24bp以上的50個(gè)序列進(jìn)行引物合成。并通過一個(gè)30個(gè)個(gè)體的秦皇島單環(huán)刺螠野生群體對(duì)這50對(duì)引物引物進(jìn)行篩選，其中能穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰目的條帶的38對(duì)

5、，其中22對(duì)具有多態(tài)性。22個(gè)微衛(wèi)星序列全部為完美型（Perfect）。其中二核苷酸微衛(wèi)星5個(gè)(22.73%)，三核苷酸微衛(wèi)星14個(gè)(63.64%)，四核苷酸微衛(wèi)星2個(gè)(9.09%)，五核苷酸微衛(wèi)星1個(gè)(4.55%)。以QHD群體30個(gè)個(gè)體DNA為模板共檢測(cè)出等位基因多達(dá)234個(gè)，每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）在7—16之間，平均等位基因數(shù)(Na)為10.636；有效等位基因數(shù)（Ne）在4.369—13.534之間，平均有效等位基因

6、數(shù)為8.096個(gè)；平均觀測(cè)雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）的值分別為0.790和0.883。多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.854，UuS34位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）最低，其值為0.736，UuS9位點(diǎn)最高，數(shù)值達(dá)到了0.921，22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均為高多態(tài)性標(biāo)記。
　　2.5個(gè)野生地理群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析
　　利用前文開發(fā)的22個(gè)高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)黃渤海海區(qū)5個(gè)野生地理群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的分析。結(jié)果表明：22個(gè)微

7、衛(wèi)星位點(diǎn)在5個(gè)群體中均表現(xiàn)為高多態(tài)性，以5個(gè)群體來看，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到等位基因數(shù)(Na)介于24—44之間，多態(tài)信息含量(PIC)介于0.921—0.967之間。5個(gè)群體總的平均有效等位基因數(shù)(Ne)范圍為6.629—8.850，平均觀測(cè)雜合度(Ho)和平均期望雜合度(He)范圍分別為0.790—0.912、0.851—0.896，DL群體的雜合度最大(He=0.8962)，WF群體的最小(He=0.8510)。平均遺傳分化指數(shù)(FST)

8、表明，群體分化水平處于中等分化水平，F(xiàn)ST值為0.0880—0.1136，WF群體分化最小，而DL群體分化最為明顯。這說明5個(gè)單環(huán)刺螠群體的遺傳多樣性較為豐富，其中DL群體的遺傳多樣性在5個(gè)群體中最高，而WF群體為最低；22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中有12個(gè)標(biāo)記在不同群體中出現(xiàn)顯著偏離Hardy—Weinberg平衡的現(xiàn)象；從Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離來看，YT和DL群體遺傳距離最遠(yuǎn)，說明兩群體間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而YT和QD群體遺傳距離最近；DL群體與其

9、他群體均有較遠(yuǎn)的遺傳距離。根據(jù)Nei遺傳距離采用UPGMA法進(jìn)行圖聚類分析顯示煙臺(tái)群體先與青島群體聚為一支，再與秦皇島群體聚類，然后跟濰坊群體聚為一支，大連群體單獨(dú)聚為一支；遺傳距離模式(IBD)顯示單環(huán)刺螠群體的遺傳距離與地理距離間不存在顯著的線性關(guān)系。以上結(jié)果表明，黃渤海海區(qū)單環(huán)刺螠遺傳豐富度較多，但群體分化程度并不大，其中YT與DL群體遺傳距離最大，可能是由于黃渤海海區(qū)海流在一定程度上阻斷基因交流造成的。
　　本研究開發(fā)的微