單環(huán)刺螠硫代謝相關(guān)基因的篩選及硫醌氧化還原酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控初探.pdf

1、外源性的硫化物存在廣泛，可以引起生物代謝損傷甚至死亡，富硫環(huán)境中的生物發(fā)展出了很多硫適應(yīng)的機(jī)制。硫化物的氧化代謝是最重要的一種，且以線粒體氧化代謝為主。硫醌氧化還原酶是線粒體氧化代謝中的第一個(gè)關(guān)鍵酶。單環(huán)刺螠隸屬于螠蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)(Echiuroidea)、螠綱(Echiurida)、無(wú)管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠屬(Urechis)，是一種主要棲息于近海岸潮間帶或潮下帶泥性底質(zhì)中的海洋底棲生物。前期研

2、究已經(jīng)證明該物種具有硫化物耐受、代謝和解毒能力。本研究篩選了單環(huán)刺螠硫代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，鑒定了他們?cè)诮M織中的表達(dá)；克隆了硫醌氧化還原酶基因5’上游調(diào)控區(qū)2505 bp的序列，預(yù)測(cè)了其可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并克隆了通用轉(zhuǎn)錄因子Sp8，體外表達(dá)和純化該重組蛋白，利用免疫學(xué)特性對(duì)Sp8和5’調(diào)控區(qū)的結(jié)合進(jìn)行了驗(yàn)證，初步探討了SQR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為深入研究硫氧化代謝的分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　 以單環(huán)刺螠50μM硫化物處理24 h組

3、為tester，未處理組為driver，采用抑制性消減雜交構(gòu)建了單環(huán)刺螠硫化物下的正向消減文庫(kù)，獲得3456個(gè)含有差異表達(dá)基因的單克隆，進(jìn)一步采用cDNA芯片技術(shù)，從該消減雜交文庫(kù)克隆里篩選獲得了104個(gè)差異表達(dá)基因，其中76個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，28個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。最終測(cè)序成功了82個(gè)差異表達(dá)基因；GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因除了參與代謝、細(xì)胞過(guò)程、免疫反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)等多種過(guò)程外，還包含大量的可能與硫代謝相關(guān)的未知序列。熒光定量PCR

4、對(duì)篩選獲得的基因進(jìn)行驗(yàn)證，8條序列中有5條序列在芯片和熒光定量PCR中有很好的一致性。
　　 采用基因組步移方法獲得硫醌氧化還原酶基因上游區(qū)調(diào)控序列，該調(diào)控序列全長(zhǎng)2505 bp，生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有TATA box，CAAT box等元件，且具有Sp，AP-1，E2F，HSF，c-Myb，NF-1等多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。采用同源克隆和RACE技術(shù)，對(duì)其中可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Sp8進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA的同源克隆。單環(huán)刺螠Sp8

5、基因全長(zhǎng)cDNA序列為1913 bp，開(kāi)放閱讀框1521 bp，編碼506個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為54.63 kDa，理論等電點(diǎn)pI為9.03?？寺苇h(huán)刺螠Sp8的ORF序列，并將其連入pET28a載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Sp8，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到了以包涵體形式表達(dá)的Sp8；其中37℃，1 mMIPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量最高。進(jìn)一步通過(guò)鎳離子金屬螯合柱純化獲得重組蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體，采用

6、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)對(duì)Sp8和sqr啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示Sp8可以和sqr啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，為研究SQR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控打下基礎(chǔ)。
　　 利用改造后的EGFP-N1質(zhì)粒載體，構(gòu)建了包含不同調(diào)控區(qū)段序列的重組pSQR-EGFP質(zhì)粒，并將全長(zhǎng)序列重組質(zhì)粒包裝成慢病毒，感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行核基因組整合表達(dá)的研究。分別采用電轉(zhuǎn)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染技術(shù)嘗試將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到單環(huán)刺螠幼蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)研究，以期篩選活性強(qiáng)的單環(huán)