硫代謝相關(guān)酶的生化分析.pdf_第1頁(yè)
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1、硫是植物生長(zhǎng)所必需的大量元素之一。植物通過(guò)根系吸收土壤中的硫酸鹽,在胞內(nèi)首先經(jīng)ATP硫酸化酶活化為腺苷5'-磷酰硫酸(adenosine5'-phosphosulfate,APS)。APS的進(jìn)一步代謝包括初級(jí)代謝和次級(jí)代謝,分別是APS還原酶催化APS生成亞硫酸鹽,腺苷5'-磷酰硫酸激酶(adenosine5'-phosphosulfate kinase,APSK)催化APS磷酸化生成3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(3'-phosphoa

2、denosine5'-phosphosulfate,PAPS),PAPS進(jìn)一步作為硫酸根的供體參與胞內(nèi)的硫酸化反應(yīng),生成副產(chǎn)物3',5'二磷酸腺苷酸(3',5'-biphosphate adenosine,PAP)。
  近年來(lái)的研究表明,擬南芥APSK在調(diào)節(jié)硫的初級(jí)和次級(jí)代謝的過(guò)程中具有重要功能,且受氧化脅迫的APSK1在C86和C119之間形成二硫鍵降低其催化活性。水稻的同工酶是否也會(huì)受到氧化還原調(diào)控尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。通過(guò)對(duì)APS

3、K序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)水稻APSK1含有與擬南芥APSK C86和C119同源的半胱氨酸。本研究對(duì)水稻APSK1進(jìn)行了基因克隆、突變和酶活分析。利用RT-PCR,獲得了APSK1基因。通過(guò)經(jīng)原核表達(dá)、純化獲得APSK1及其雙突變蛋白C36A/C69A。體外酶活分析表明,在氧化環(huán)境中APSK1活性受到抑制,而C36A/C69A雙突變蛋白不受氧化環(huán)境的影響。結(jié)合模擬的三維結(jié)構(gòu),我們推測(cè)水稻APSK第36位與第69位半胱氨酸之間可形成二硫鍵,而

4、水稻受到氧化脅迫時(shí)可降低APSK活性,促進(jìn)硫合成GSH提高水稻的抗氧化能力。
  3',5'二磷酸核苷酸酶(3',5'-bisphosphate nucleotidase)催化PAP和PAPS的3'磷酸水解生成AMP和APS,是胞內(nèi)硫代謝的重要調(diào)控者之一。研究發(fā)現(xiàn),高表達(dá)3',5'二磷酸核苷酸酶可提高植物抗鹽性。酵母3',5'二核苷酸酶亦稱為HAL2,參與細(xì)胞硫代謝和抗鹽過(guò)程。HAL2活性的改變可調(diào)節(jié)胞內(nèi)PAP濃度,從而影響磺基轉(zhuǎn)

5、移酶,?;d體蛋白合酶和RNA加工酶的活性[1],進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。
  本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明,HAL2突變蛋白G236V對(duì)PAP有較高的催化效率(1.5×107 M-1·s-1),而對(duì)PAPS有極低的催化效率(2.6×103 M-1·s-1)。本文通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)G236V分析其對(duì)細(xì)胞的影響,與預(yù)期結(jié)果相反,我們發(fā)現(xiàn)在無(wú)還原性硫存在的培養(yǎng)基中,G236V較HAL2的表達(dá)極大降低了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。HAL2和G2

6、36V可水解1,6二磷酸果糖(fructose1,6-bisphosphate,F(xiàn)BP),是PAP水解的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。活性分析發(fā)現(xiàn)G236V在高濃度FBP的情況下,較HAL2具有更高的水解FBP活性。我們推測(cè)G236V對(duì)胞內(nèi)FBP的大量水解是降低細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因。丙酮酸鈉作為碳源的實(shí)驗(yàn)表明,其不能恢復(fù)G236V過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低,我們推測(cè)丙酮酸鈉不是大腸桿菌的優(yōu)質(zhì)碳源是導(dǎo)致此結(jié)果的原因。所以我們認(rèn)為G236V通過(guò)降解1,6二

7、磷酸果糖,影響了細(xì)胞的能量代謝,從而降低了細(xì)胞的繁殖速度。
  為進(jìn)一步驗(yàn)證此假設(shè),我們構(gòu)建了大腸桿菌HAL2同源蛋白CysQ(V152,功能與G236V相當(dāng))及其突變體V152G(功能與HAL2相當(dāng))的表達(dá)載體。與上述結(jié)果相反,V152G在大腸桿菌中的過(guò)量表達(dá)降低了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。進(jìn)一步分析,我們發(fā)現(xiàn)FBP對(duì)CysQ與V152G水解PAPS抑制能力相當(dāng),他們水解FBP的能力也相當(dāng);而V152G(Km=24.18μM)較CysQ(

8、Km=35.31μM)對(duì)PAPS具有更強(qiáng)的親和力,所以V152G的過(guò)表達(dá)將有效降低PAPS含量及硫的還原速度,從而可能降低細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。
  綜上所述,本論文克隆分析了氧化還原條件對(duì)水稻APSK的功能調(diào)控,以及3',5'二磷酸核苷酸酶的點(diǎn)突變對(duì)其活性及生理功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化條件,可促進(jìn)水稻APSK分子間二硫鍵的形成,降低其磷酸化APS的能力;HAL2較其突變體G236V具有較低的水解FBP水解能力,較高的PAPS水解能力;C

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