生化分析考試要點

1、層析法：層析法：利用混合樣品中，不同物質(zhì)在固定相和流動相中的分布程度不同而進行分離的方法稱其為層析法（或色譜法）。特點：應用范圍廣；可對物質(zhì)進行定量、定性和純度鑒定；柱層析（columnchromatography）將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品在層析柱中進行分離。紙層析（paperchromatography）用濾紙作液體的載體（擔體suppt），點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析（thinlayerchromatogra

2、phy）將適當粒度的吸附劑在玻璃板上鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定分配定律：分配定律：分配系數(shù)K=試樣在固定相中的濃度試樣在移動相中的濃度=CASCAM（1）在定溫、定壓下，在一定的溶劑系統(tǒng)中，一定的物質(zhì)其K值保持不變，不同的物質(zhì)其K值不同（2）當溫度、壓力或溶劑系統(tǒng)改變時，對于一定的物質(zhì)來說，其K值也隨之改變（3）K值大于1，物質(zhì)在S相中的濃度大于其在M相中的濃度，反之則小分配比率（容量因子）k’=化合物在固定相中的

3、量化合物在移動相中的量=pqK=（pVs）(qVm)（G=k’）=KVsVm容量因子與溶劑系統(tǒng)的組成、體系的溫度、壓力有關，還與兩相的體積比值有關理論塔板數(shù)N及理論塔板高度HETP=L（柱長）N影響因素HETP=Cmd2uDmCm溶質(zhì)分子的濃度；d固定相顆粒直徑；u流速；Dm溶質(zhì)分子的擴散系數(shù)高流速可以高樣品輸出性和高產(chǎn)量；低流速可提高分辨率影響分離的因素：①洗脫曲線的參數(shù)②分離度Rs③分離系數(shù)α（代表了兩個物質(zhì)在相同的色譜條件下的分離

4、選擇性樣品區(qū)帶擴散的因素：柱內(nèi)擴散（渦流擴散、縱向擴散、傳質(zhì)速率）、柱外擴散（樣品、層析介質(zhì)、裝柱、層析條件、死體積）塔板理論塔板理論：分配系數(shù)大的組分，每次達到平衡的時間長，從層析柱中后流出。一個層析柱的塔板數(shù)越多，分離次數(shù)越多，柱效越高理論塔板高度理論塔板高度HETP=Cmd2uDmCm溶質(zhì)分子的濃度溶質(zhì)分子的濃度d固定相顆粒直徑固定相顆粒直徑u流速流速Dm溶質(zhì)分子的擴散系數(shù)溶質(zhì)分子的擴散系數(shù)聚焦層析聚焦層析（chromatofoc

5、using）它是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點的差異與蛋白質(zhì)的離子交換作用進行分離純化的。適用于分離某些蛋白質(zhì)分子量和極性方面的性質(zhì)十分接近，而等電點有區(qū)別的物質(zhì)特點：特點：①離容量大（能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品）②辨率很高（有洗脫峰被聚焦效應濃縮，峰寬度可達0.040.05pH單位）；③作簡單（不需特殊的操作裝置）從分離的蛋白質(zhì)中去除多緩沖劑的方法：沉淀法。凝膠過濾法、親和層析法、疏水層析法。親和層析親和層析AC（AffinityChromatog

6、raphy）：根據(jù)生物分子間親和吸附和解吸的原理建立起來①強酸型：SM磺甲基；SE磺乙基強酸性，用于極低pH；SP磺丙基；P磷酸低pH②弱酸型：CM羧甲基pH4以上陰離子交換劑（堿性）：陰離子交換劑中的可解離基團是：伯胺:NH3；仲胺:NH2CH3叔胺:NH(CH3)2；季胺:N(CH3)3（弱→強）①強堿型：Q三甲基氨基甲基；TEAE三乙基氨基乙基3QAE二乙基(α羥丙基)氨基乙基②弱堿型：DEAE二乙基氨基乙基pH8.6以下支持物：

7、樹脂；纖維素；凝膠（葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠）離子交換劑的理化性質(zhì)離子交換劑的理化性質(zhì)：酸堿性，交換容量，顆粒直徑，網(wǎng)孔大小，使用的pH范圍，使用的溫度范圍，耐受的溶劑系統(tǒng)，顏色，耐壓程度，氣味，比重，吸水膨脹率。離子交換平衡的選擇性系數(shù)離子交換平衡的選擇性系數(shù)：K磺酸型離子交換樹脂對陽離子的親和規(guī)律：在稀的水溶液中，同價離子：原子序數(shù)↑，離子半徑↑水化半徑↓，親和力↑；不同價離子：價數(shù)↑，親和力↑。LiSO22C2O42INO2CrO4

8、2BrscnClHCOOOHFCH3COO離子交換動力學：膜擴散離子交換動力學：膜擴散→粒子擴散粒子擴散→交換反應交換反應→粒子擴散粒子擴散→膜擴散膜擴散吸附狀態(tài)吸附狀態(tài)：牢固吸附、有限吸附平衡、完全解吸。轉(zhuǎn)變條件轉(zhuǎn)變條件：pH，離子強度離子交換柱層析的洗脫方式洗脫方式：①恒溶劑洗脫：采用固定pH及離子強度的洗脫方法；②梯度洗脫：采用連續(xù)改變pH、離子強度的洗脫方法（梯度類型包括pH、離子強度、pH與離子強度）③階段洗脫：采用相繼改變p

9、H、離子強度的洗脫方法陰離子pH從高到低e.g.陽離子B吸附在柱上，洗脫可采用不同的緩沖液，開始時采用氫離子濃度較低的緩沖液，然后在該緩沖液中逐漸增加氫離子濃度以取代吸附在柱上的B離子；或在同一種pH值的緩沖液中增加離子強度；或在相同pH值和離子強度的緩沖液中加入一種比離子交換層析介質(zhì)親和力更強的陽離子來取代吸附在柱上的B離子。對于具有兼性離子的生物大分子，要對溶液的pH值，生物大分子的等電點和離子交換層析介質(zhì)三種情況同時進行考慮。介質(zhì)

10、選擇：緩沖液的pH值高于樣品等電點，選擇陰離子交換介質(zhì)，蛋白質(zhì)向陽極跑反向?qū)游龇聪驅(qū)游鯮PC：是利用被分離樣品中不同生物分子表面的極性差別，而將其分離純化的一種層析技術。反相層析的固定相是非極性的，流動相繼續(xù)大，非極性樣品親和力大用有機溶劑，極性小，則非極性樣品親和力小，先出來特點特點：高效，一般用于分離小分子極性大的物質(zhì)金屬螯合層析金屬螯合層析MCC或IMAC金屬螯合層析是利用不同蛋白質(zhì)分子表面所含組氨酸的差別而將其分離純化的一種層析