昆蟲(chóng)鞘脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)酶的生化特征和功能.pdf

1、中性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶是生物體體內(nèi)調(diào)節(jié)鞘脂質(zhì)代謝的重要酶類。中性鞘磷脂酶水解神經(jīng)鞘磷脂生成神經(jīng)神經(jīng)酰胺，中性神經(jīng)酰胺酶水解神經(jīng)酰胺生成神經(jīng)鞘氨醇。本研究以赤擬谷盜和灰飛虱為研究對(duì)象，對(duì)赤擬谷盜和灰飛虱的中性神經(jīng)酰胺酶、灰飛虱的中性鞘磷脂酶生化特征進(jìn)行了研究，并且探索了它們?cè)诔鄶M谷盜和灰飛虱體內(nèi)可能的功能。以下是本研究的主要結(jié)果:
　　 1.從赤擬谷盜基因組中的中性神經(jīng)酰胺酶的三個(gè)同源基因中篩選得到了赤擬谷盜的中性神經(jīng)酰胺酶

2、Tncer.Tncer蛋白序列和果蠅、水稻、人類、銅綠假單胞桿菌的中性神經(jīng)酰胺酶蛋白序列的相似性分別為49.1％、38.1％、36.8％和33.4％;Tncer表現(xiàn)了其獨(dú)特的生化特性:雖然中性、堿性、酸性神經(jīng)酰胺酶的劃分是根據(jù)酶發(fā)揮最大活性的pH值不同來(lái)劃分，但是越來(lái)越多的研究表明中性神經(jīng)酰胺酶在最適pH不僅僅是在中性的pH范圍內(nèi)，Tncer的最適pH為pH5，但是它在pH5～12范圍的活性差別不大，表明Tncer可以在酸性、中性和堿性

3、的pH環(huán)境中都發(fā)揮很高的活性;Tncer對(duì)底物的選擇沒(méi)有專一性，它可以水解從短鏈到超長(zhǎng)鏈的神經(jīng)酰胺，但是對(duì)短鏈神經(jīng)酰胺如C6-Ceramide的水解能力較低;Tncer發(fā)揮體外活性的最適溫度為37℃;它不依賴二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)發(fā)揮活性，但是活性可以被Fe2+抑制;Tncer在精巢和卵巢中的表達(dá)量最大，成蟲(chóng)羽化后在卵巢的成熟過(guò)程中Tncer的表達(dá)水平表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，說(shuō)明Tncer在卵子的形成過(guò)程中很可能發(fā)揮著重要的作用;Tncer在粉紋夜蛾細(xì)

4、胞中主要分布在細(xì)胞膜上，這和哺乳動(dòng)物中性神經(jīng)酰胺酶的亞細(xì)胞定位是相同的。
　　 2.從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到中性神經(jīng)酰胺酶的序列?；绎w虱中性神經(jīng)酰胺酶LsnCer和赤擬谷盜、果蠅、人類、銅綠假單胞桿菌、水稻的中性神經(jīng)酰胺酶的同源性分別為50.62％、47.46％、37.11％、36.14％、36.84％;LsnCer的最適pH為8，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性的環(huán)境中幾乎沒(méi)有活性;LsnCer對(duì)底物的選擇也沒(méi)有專一性，它偏好中長(zhǎng)鏈的神經(jīng)酰胺

5、;對(duì)短鏈和超長(zhǎng)鏈的神經(jīng)酰胺水解能力較弱;LsnCer能夠更有效地水解含不飽和碳鏈鞘氨醇基團(tuán)的神經(jīng)酰胺.LsnCer的活性可以被和Zn2+顯著抑制;其體外活性的最適溫度也是37℃;LsnCer在灰飛虱的精巢和卵巢中的表達(dá)量最高;它在粉紋夜蛾細(xì)胞中的也主要位于細(xì)胞膜上.
　　 3.攜帶水稻條紋葉枯病病毒的灰飛虱體內(nèi)有較高的中性神經(jīng)酰胺酶表達(dá)量，且在pH8的條件下神經(jīng)酰胺酶活性較高。分別用吡蟲(chóng)啉、氟蟲(chóng)腈和毒死蜱滴定灰飛虱四齡若蟲(chóng)后發(fā)現(xiàn)

6、LsnCer的表達(dá)水平在4小時(shí)后顯著上升，并且酶活水平在4小時(shí)后也顯著上升。
　　 4.在灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中拼接得到中性鞘磷脂酶1的同源序列LsnSMase，將LsnSMase和其它已知的中性鞘磷脂酶1做序列聯(lián)配發(fā)現(xiàn)，一些氨基酸在這些中性鞘磷脂酶中是極為保守的;LsnSMase蛋白的C端323-342AA和355-374AA為兩個(gè)跨膜區(qū)域;LsnSMase的活性依賴Mg2+，DTT能夠提高LsnSMase的活性，EGTA能夠顯

7、著提高LsnSMase的活性，但是同為離子螯合劑的EDTA能夠顯著抑制LsnSMase的活性，LsnSMase的活性能夠完全被Zn2+抑制。同時(shí)加入Mg2+，DTT或Mg2+，EGTA或Mg2+、EDTA都能夠極其顯著的提高LsnSMase的活性;LsnSMase在灰飛虱雌蟲(chóng)的卵巢中的表達(dá)量最高。
　　 本研究首次對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的鞘脂質(zhì)代謝途徑進(jìn)行了探索，明確了中性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶的詳細(xì)生化特征，分析了它們?cè)谏矬w內(nèi)可能具有