三種不同結(jié)構(gòu)的葉瓜參鞘脂對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用研究.pdf

1、海參鞘脂是海參體內(nèi)的一類重要脂質(zhì)，主要包括腦苷脂、神經(jīng)酰胺及長(zhǎng)鏈堿等。其中，海參腦苷脂由神經(jīng)酰胺和糖基組成，神經(jīng)酰胺是由長(zhǎng)鏈堿與長(zhǎng)鏈脂肪酸經(jīng)脫水以酰胺鍵連接而成。研究發(fā)現(xiàn)，海參鞘脂具有抗腫瘤、改善阿爾茨海默癥、改善糖脂代謝等功效。脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致肥胖等代謝綜合征的重要因素，目前關(guān)于海參鞘脂對(duì)脂質(zhì)代謝的影響已有初步報(bào)道，但其作用機(jī)制仍未闡明，且關(guān)于海參鞘脂中起作用的活性片段也沒(méi)有明確的定論。本文以鞘脂含量較高的葉瓜參(Cu

2、cumaria frondosa)為實(shí)驗(yàn)材料，分離、制備了葉瓜參腦苷脂(Cerebroside from the sea cucumber C.frondosa，Cf-Cb)、神經(jīng)酰胺(Ceramidefrom the sea cucumber C.frondosa，Cf-Cm)及長(zhǎng)鏈堿(Long-chain base from thesea cucumber C.frondosa，Cf-LCB)3種鞘脂，系統(tǒng)研究了其調(diào)控脂肪細(xì)胞分化與

3、脂質(zhì)代謝的作用及其機(jī)制，并闡明了3種葉瓜參鞘脂中起作用的活性片段。主要研究結(jié)果如下:
　　采用傳統(tǒng)雞尾酒法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，研究了3種葉瓜參鞘脂對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。油紅O染色結(jié)果顯示，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均能顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，且對(duì)分化早期的抑制效果最強(qiáng)。C/EBPα和PPARγ是脂肪細(xì)胞分化末期最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。qRT-PCR及Western blotting結(jié)果

4、表明，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB對(duì)C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均具有顯著的抑制作用。WNT/β-catenin通路在脂肪細(xì)胞分化中具有重要作用，激活后顯著抑制脂肪細(xì)胞分化。qRT-PCR結(jié)果表明，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB顯著地上調(diào)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因FZ1、LRP5、LRP6、β-catenin、CCND1和c-myc mRNA表達(dá)，但對(duì)Wnt10b及GSK3β的表達(dá)無(wú)顯著性影響。

5、Western blotting結(jié)果顯示，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB顯著促進(jìn)LRP6和β-catenin的蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞核內(nèi)β-catenin含量，提示3種葉瓜參鞘脂均能促進(jìn)WNT/β-catenin通路的激活。21H7是β-catenin的抑制劑，可以特異性的抑制WNT/β-catenin通路的激活。結(jié)果表明，21H7干預(yù)細(xì)胞后，3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化率，C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均提高;而β-ca

6、tenin蛋白表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白含量，CCND1和c-myc的mRNA表達(dá)均顯著降低。Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均能顯著改善21H7的作用效果，進(jìn)一步驗(yàn)證其可促進(jìn)WNT/β-catenin通路的激活。綜上所述，3種葉瓜參鞘脂通過(guò)激活WNT/β-catenin通路抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。
　　以3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，研究3種葉瓜參鞘脂對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，Cf-Cb、C

7、f-Cm和Cf-LCB均顯著降低細(xì)胞中TG含量，升高培養(yǎng)上清中FFA含量，提示其能抑制脂質(zhì)累積，促進(jìn)脂質(zhì)分解。脂質(zhì)合成和分解的關(guān)鍵酶是調(diào)控脂質(zhì)代謝的重要因子，是目前重要的肥胖候選研究基因。Western blotting結(jié)果顯示，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均能顯著抑制脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因GPAT和FAS的蛋白表達(dá)，增加脂質(zhì)分解關(guān)鍵基因HSL和CPT-1的蛋白表達(dá)。AMPK是細(xì)胞能量代謝的總開關(guān)，在調(diào)控細(xì)胞能量代謝中起到重要的作用。

8、Westem blotting結(jié)果表明，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均顯著促進(jìn)AMPK及ACC蛋白的磷酸化，提示其能激活A(yù)MPK通路。Compound C是AMPK蛋白的抑制劑，可以降低AMPK的活性。結(jié)果表明，Compound C干預(yù)下，TG含量、GPAT和FAS的蛋白表達(dá)均升高;而FFA含量，HSL和CPT-1蛋白表達(dá)，AMPK和ACC的磷酸化水平均降低。Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均顯著改善Compound C的作

9、用效果，進(jìn)一步驗(yàn)證其能激活A(yù)MPK通路。綜上所述，3種葉瓜參鞘脂通過(guò)激活A(yù)MPK通路抑制脂質(zhì)合成，促進(jìn)脂質(zhì)分解，從而改善脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。
　　通過(guò)建立濃度相同或長(zhǎng)鏈堿含量相同的3種鞘脂兩個(gè)作用體系，比較研究了Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB的作用效果，以期闡明3種葉瓜參鞘脂中起作用的活性片段。結(jié)果表明，當(dāng)3種鞘脂濃度相同時(shí)，其抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化，促進(jìn)WNT/β-catenin通路的激活，改善脂質(zhì)代謝和激活A(yù)

10、MPK通路的作用效果以Cf-LCB為最優(yōu)。而當(dāng)3種鞘脂長(zhǎng)鏈堿含量相同時(shí)，Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化，促進(jìn)WNT/β-catenin通路的激活，改善脂質(zhì)代謝和激活A(yù)MPK通路的作用效果相當(dāng)，提示3種葉瓜參鞘脂中起作用的活性片段為長(zhǎng)鏈堿。
　　本文首次系統(tǒng)研究了葉瓜參鞘脂對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用及其機(jī)制，并進(jìn)一步闡明了其中起作用的活性片段，為海參鞘脂的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和