牙鲆和大菱鲆糖代謝及瘦素和脂聯(lián)素相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、本文以我國北方海水養(yǎng)殖肉食性魚類牙鲆（Paralichthys olivaceus）和大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）為研究對(duì)象，進(jìn)行基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)的高糖負(fù)荷后牙鲆血清代謝組學(xué)研究，以及不同飼料糖脂比對(duì)大菱鲆瘦素及其受體和脂聯(lián)素受體基因表達(dá)影響的研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.高糖負(fù)荷后牙鲆血清代謝組學(xué)研究
　　本研究采用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法，分

2、析兩種不同糖耐量實(shí)驗(yàn)（腹腔注射葡萄糖和口腔灌喂葡萄糖）后牙鲆（225±50g）血清中代謝物變化。結(jié)果顯示，兩種不同實(shí)驗(yàn)方式對(duì)牙鲆血糖、血清胰島素以及代謝變化影響存在很大差異。牙鲆腹腔注射葡萄糖（500mg/ml，1g/kg體重）后，血糖水平在5h達(dá)到峰值（20.06±1.92mM），24h時(shí)血糖與0h無顯著差異(P＞0.05);血清胰島素水平在葡萄糖注射后急劇下降，在3h達(dá)到最低（1.58±0.21mIU/L），在24h時(shí)恢復(fù)原值(3.

3、03±0.06mIU/L);與0h相比，注射葡萄糖后3h血清中有6種代謝物水平顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為:塔羅糖、木糖、異麥芽糖、半乳糖醛酸、羥基脲和環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物;到第5h血清中有9種代謝物水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，分別為:塔羅糖、木糖、異麥芽糖、黃嘌呤、乳酸、烏頭酸、茉莉酮酸甲酯、環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物和腎上腺皮質(zhì)酮;3h與5h的血清中只有1種差異代謝物皮質(zhì)酮(P＜0.05)。牙鲆口腔灌喂葡萄糖(500mg/ml，1.

4、67g/kg體重)后，血糖水平在3h達(dá)到最大值（1.90±0.23mM），7h恢復(fù)至原來水平（0.89±0.04mM）;而血清胰島素水平在3h上升至3.37±0.34mIU/L，5h時(shí)恢復(fù)至原水平（2.56±0.41mIU/L）;與0h相比，灌喂葡萄糖后3h時(shí)牙鲆血清中顯著上調(diào)的代謝物有5種（P＜0.05），分別是:塔羅糖、乳酸、3-羥鄰氨基苯甲酸、黃嘌呤和次黃嘌呤;但在5h時(shí)血清中沒有顯著增多的代謝物，只有1種代謝物半乳糖酸含量顯著下

5、降（P＜0.05），而5h時(shí)血清中有2種代謝物水平顯著低于3h(P＜0.05)，這2種代謝物是木糖和3-羥鄰氨基苯甲酸。此外，我們還對(duì)上述2種不同方式糖負(fù)荷后同一時(shí)間點(diǎn)的血清代謝物進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示在高糖負(fù)荷后3h，注射組血清中有4種代謝物水平顯著高于灌喂組(P＜0.05)，分別是:塔羅糖、異麥芽糖、環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物和鄰羥基苯丙酸;5h時(shí)注射組血清中有6種代謝物含量顯著高于灌喂組（P＜0.05），分別是塔羅糖、異麥芽糖、木糖、環(huán)己

6、烯四醇β環(huán)氧化物、烏頭酸和半乳糖酸，但有1種代謝物N-氨甲酰谷氨酸含量顯著低于灌喂組（P＜0.05）。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，以及參考已有報(bào)道分析得出，這些差異代謝物表明牙鲆可以通過多種糖代謝途徑進(jìn)行血糖水平的調(diào)節(jié)，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、糖原合成、戊糖與葡萄糖醛酸互變以及戊糖磷酸途徑，同時(shí)氨基酸代謝和腸道微生物的代謝也會(huì)對(duì)血糖變化產(chǎn)生響應(yīng)，間接起到加速血糖水平下調(diào)的作用。值得注意的是血清中鄰羥基苯丙酸和N-氨甲酰谷氨酸水平與機(jī)體內(nèi)瘦素、

7、胰島素、胰高血糖素和生長抑素等激素水平有一定相關(guān)性，這兩種代謝物以及皮質(zhì)酮水平的變化表明，皮質(zhì)酮、瘦素、胰島素、胰高血糖素和生長抑素等激素可能在牙鲆體內(nèi)各糖代謝途徑中起到一定的調(diào)控作用。
　　2.大菱鲆瘦素及其受體、脂聯(lián)素受體基因序列全長克隆和分析
　　在本研究中，利用分子克隆和RACE技術(shù)克隆到了大菱鲆瘦素(LEP)及其受體(LEPR)和脂聯(lián)素兩種受體（AdipoR1和AdipoR2）eDNA序列全長。大菱鲆LEPcDNA

8、序列全長1126bp，共編碼157個(gè)氨基酸。大菱鲆LEP氨基酸序列與人的LEP同源性很低，只有18.8％，但它們預(yù)測的三級(jí)結(jié)構(gòu)保守性卻很高。大菱鲆LEPR cDNA序列全長4248bp，共編碼1173個(gè)氨基酸，大菱鲆LEPR氨基酸序列與人的同源性為28％，與點(diǎn)帶石斑魚的同源性為82％，在脊椎動(dòng)物中保守存在的所有重要功能域在該序列中均有發(fā)現(xiàn)。組織差異表達(dá)結(jié)果顯示大菱鲆LEP主要在腦、眼和肝臟中表達(dá)，LEPR主要表達(dá)的場所是肝臟和腎臟。大菱

9、鲆AdipoR1核苷酸序列全長1125bp，共編碼375個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與其他脊椎的同源性都很高，人為80％，羅非魚為97％。大菱鲆AdipoR2核苷酸序列全長1940bp，共編碼380個(gè)氨基酸，氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物同源性也都很高，人為78％，羅非魚為92％。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7個(gè)明顯的跨膜區(qū)，最優(yōu)拓?fù)淠Ｐ蜑镹端在細(xì)胞內(nèi)側(cè)模型，與其他脊椎動(dòng)物相同。大菱鲆AdipoR分布廣泛，Adi

10、poR1在鰓和腎中表達(dá)水平最高，AdipoR2則在鰓、胃、腸、腎和幽門盲囊中的表達(dá)量都較多，但在肌肉中表達(dá)量較少。
　　3.不同飼料糖脂比對(duì)大菱鲆瘦素及其受體、脂聯(lián)素受體基因表達(dá)的影響
　　本研究配制不同糖脂比（1∶6、1∶2、2∶1和14∶1）的飼料，養(yǎng)殖大菱鲆9周后，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了大菱鲆肝臟中瘦素，肝臟和肌肉中瘦素受體和脂聯(lián)素受體基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，飼料糖脂比從1∶6升高到2∶1對(duì)瘦素和瘦素受體基因

11、表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），但在糖脂比上升到14∶1時(shí)，肝臟瘦素表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而肝臟瘦素受體的mRNA水平卻顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與其他2組無顯著差異（P＞0.05），此時(shí)肌肉中瘦素受體的mRNA水平最高，顯著高于其他3組（P＜0.05）。飼料糖脂比的變化沒有對(duì)肝臟中AdipoR的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），然而，與糖脂比為1∶6的對(duì)照組相比，大菱鲆肌肉中AdipoR1的表達(dá)量在1∶2的處理組