解脲脲原體14種血清型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、研究背景:
　　 解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，Uu）屬于柔膜體綱，是一類介于細(xì)菌和病毒之間，沒有細(xì)胞壁，目前能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖的最小原核微生物。目前為止，已知與人類疾病有關(guān)的有14種血清型，最近14種血清型又根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)被劃分為兩個(gè)生物群，即微小脲原體(U.parvum，UPA)包括血清型1，3，6，14;解脲脲原體(U.urealyticum，UUR)包括其余10種血清型。Uu雖然廣泛存在于

2、健康人群泌尿生殖道中，但同時(shí)它們還和很多疾病有關(guān)，如非淋球菌性尿道炎（Nongonococcal urethritis，NGU）、絨毛膜羊膜炎等。關(guān)于Uu的致病機(jī)制目前還不清楚。多年來人們一直在猜測(cè)某一群或血清型和特定疾病之間的相關(guān)性，但仍尚未有統(tǒng)一的意見，其主要原因是缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)化、商品化的14種血清型檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的以抗體為基礎(chǔ)的分型方法由于操作繁瑣，可重復(fù)性差一直未得到廣泛應(yīng)用。近年來分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)Uu鑒定和分型的方法得到了快速

3、發(fā)展，但由于Uu群內(nèi)各血清型基因序列高度一致，目前為止還沒有一種理想的方法檢測(cè)Uu14種血清型，所以建立一種快速、精準(zhǔn)的分型方法在研究Uu致病性和流行病學(xué)調(diào)查方面就顯得尤為重要。本研究旨在建立Uu14種血清型分子生物學(xué)檢測(cè)方法，為今后在血清型水平進(jìn)一步研究Uu的致病性奠定方法學(xué)基礎(chǔ)，并應(yīng)用此方法對(duì)分離于健康人群生殖道的Uu進(jìn)行分型，了解健康人群中Uu血清型的分布，為流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.收集20

4、12年3-9月在邵逸夫醫(yī)院體檢的女性宮頸分泌物標(biāo)本220例，體檢者均無泌尿生殖道炎癥癥狀。
　　 2.將標(biāo)本接種于液體選擇性培養(yǎng)基，陽性培養(yǎng)液接再轉(zhuǎn)種于A7固體培養(yǎng)基，觀察典型菌落進(jìn)一步確認(rèn)。
　　 3.確認(rèn)為Uu陽性的液體培養(yǎng)液制備DNA模板。
　　 4.通過對(duì)Uu14種血清型全基因組進(jìn)行評(píng)估，設(shè)計(jì)各血清型特異的引物和探針，建立檢測(cè)Uu14種血清型的熒光定量PCR法，用ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證其特異性和敏感性。

5、r>　　 5.參考文獻(xiàn)對(duì)上述臨床標(biāo)本進(jìn)行分群，然后應(yīng)用已建立的熒光定量PCR方法進(jìn)一步分型。
　　 6.統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立了一套Uu14種血清型熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢出限范圍為22拷貝/微升（血清型1）到3200拷貝/微升（血清型5）。
　　 2.臨床標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果:220例臨床標(biāo)本液體培養(yǎng)共有108例陽性，經(jīng)A7固體培養(yǎng)基培養(yǎng)確認(rèn)后共有106例陽性標(biāo)本。
　　 3.

6、臨床Uu陽性標(biāo)本分群結(jié)果:106株Uu陽性標(biāo)本中75株(70.8％)為UPA;29株(27.3％)為UUR;2株(1.9％)未能分群;未分到UPA和UUR混合陽性株。
　　 4.臨床Uu陽性標(biāo)本分型結(jié)果:單一血清型的占83.0％（血清型1占30.2％、血清型3占22.6％、血清型6占7.5％、血清型9占7.5％）、混合血清型的占11.3％、未能分血清型的占5.7％。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立了一套完整的U