一種基于TCC的大腸桿菌染色體相互作用高通量測定方法.pdf

1、細(xì)菌作為地球上最古老的物種之一，具有比真核生物更簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的遺傳物質(zhì)組織調(diào)節(jié)方式。作為遺傳學(xué)上經(jīng)典的模式生物，大腸桿菌的染色體以1000倍以上的比例壓縮凝聚在細(xì)胞中，與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，RNA等共同構(gòu)成擬核結(jié)構(gòu)。近年來的研究表明細(xì)菌染色體并不是像人們過去認(rèn)為的那樣雜亂的壓縮在擬核區(qū)域內(nèi)，而是有著一定的層次，經(jīng)過有序地包裝，組織來形成高級結(jié)構(gòu)。
　　細(xì)菌基因組中被同一個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的操縱子可組成調(diào)節(jié)子(regulon)結(jié)構(gòu)。

2、有研究表明組成同一調(diào)節(jié)子的操縱子之間可能在線性距離上相距甚遠(yuǎn)，但是可以通過染色體的高級結(jié)構(gòu)在空間上相互作用。這說明細(xì)菌基因表達(dá)過程可被遠(yuǎn)程調(diào)控元件所調(diào)控，且存在三維空間網(wǎng)絡(luò)。所以染色體的高級結(jié)構(gòu)不但能夠使得細(xì)菌的基因組高度凝聚以適應(yīng)較小的擬核空間，同時也廣泛的影響著細(xì)菌的基因調(diào)控過程。
　　細(xì)菌染色體內(nèi)部存在著廣泛的相互作用，在擬核范圍內(nèi)形成復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)。為了探明擬核內(nèi)染色體的相互作用情況，并得到染色體內(nèi)高通量互作數(shù)據(jù)，我們參考

3、了最新的高通量染色體構(gòu)象俘獲TCC技術(shù)，對部分步驟進(jìn)行了修改，建立了一種高通量測定細(xì)菌的全基因組核酸交互的方法。將對數(shù)期生長的大腸桿菌菌體用濃度為1％的甲醛進(jìn)行細(xì)胞交聯(lián)，選取超聲波物理打斷的方式進(jìn)行無偏好性的核酸片段化，蛋白質(zhì)核酸的復(fù)合物補(bǔ)齊末端后，生物素化標(biāo)記樣品中的蛋白，利用近距離連接反應(yīng)的原理進(jìn)行分子內(nèi)末端的連接。將帶有生物素標(biāo)記純化連接片段克隆到載體PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案的可行性。在所有的克隆測序結(jié)果中，有10％～2

4、0％的克隆片段是由來自不同基因座位的序列拼接而成的。初步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方案的可行性。
　　借鑒TCC(TetheredConformationCapture)中將擬核蛋白生物素化處理的方法，使交聯(lián)復(fù)合物分子固定在支持物上進(jìn)行連接，避免了游離片段之間的隨機(jī)接觸，提高了增加了連接片段的可信度。另一方面利用生物素化的蛋白質(zhì)作為親和純化標(biāo)簽篩選交聯(lián)復(fù)合物，大大提高了高通量篩選的效率。繼而通過第二代測序技術(shù)得到高通量的大腸桿菌染色體的相互作用數(shù)

5、據(jù)。利用生物信息學(xué)工具對高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果表明大腸桿菌K-12菌株對數(shù)生長期細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)內(nèi)部存在廣泛的交互，且這些交互多集中在復(fù)制起始位點(diǎn)附近，且經(jīng)過COG分類表明染色質(zhì)交互高峰區(qū)域基因的功能與對數(shù)生長期最旺盛的細(xì)胞過程如細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯，物質(zhì)代謝等相匹配。
　　通過對染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)及TCC技術(shù)的借鑒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和有限片段克隆測序的驗(yàn)證以及對高通量測序數(shù)據(jù)的分析處理，我們初步建立了可適用于第二代高通量測序平