高靈敏人血清HER2蛋白檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、背景和目的：
　　對(duì)于人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的成員 HER2/P185/ErbB2來(lái)說(shuō)，其過(guò)表達(dá)與臨床上多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中包括乳腺癌、胃癌、肺癌及卵巢癌等。血清中 HER2蛋白的含量可直接影響腫瘤病人的化療效果及生存時(shí)間。目前臨床上通常用檢測(cè)腫瘤病人血清中 HER2蛋白的表達(dá)水平用作是多種腫瘤的診斷以及治療方案制定的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，例如胃癌、乳腺癌等，其可認(rèn)為是判斷腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在臨床上常常使用血清中 HER

2、2水平的變化趨勢(shì)用作評(píng)價(jià)腫瘤的治療效果以及作為腫瘤患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)，但是由于目前國(guó)內(nèi)靈敏度較高的血清 HER2的檢測(cè)方法的技術(shù)尚缺，因此本實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)人血清中 HER2蛋白含量高靈敏檢測(cè)技術(shù)，并進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測(cè)，為腫瘤治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。
　　材料與方法：
　　本實(shí)驗(yàn)室從以下幾方面來(lái)建立人血清HER2檢測(cè)方法：（1）抗HER2的單克隆抗體HuA21與HerA以及高純度的標(biāo)準(zhǔn)抗原HER2-ECD的制備：以適應(yīng)的濃度接種培養(yǎng)本

3、實(shí)驗(yàn)室保存的CHO細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)至90%密度時(shí)分別轉(zhuǎn)染含HuA21、HerA、HER2-ECD基因的表達(dá)載體，待24小時(shí)的繼續(xù)培養(yǎng)后用胰酶進(jìn)行消化并將其傳代培養(yǎng)，并往培養(yǎng)基內(nèi)加入0.3mg/ml Zeocin混合成選擇性培養(yǎng)基用來(lái)篩選抗性克隆。將得到的高表達(dá)抗性克隆逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，收取培養(yǎng)的上清液，進(jìn)一步純化、濃縮，采用 SDS-PAGE非還原電泳技術(shù)純化抗體 HuA21、HerA，采用 BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定HER2-ECD標(biāo)準(zhǔn)抗

4、原的含量，并與美國(guó)批準(zhǔn)臨床使用的血清HER-2/neu ELISA測(cè)定試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。（2）運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）技術(shù)，分別以抗HER2單克隆抗體HuA21為包被抗體，生物素標(biāo)記的HerA作為檢測(cè)抗體，將得到的抗原標(biāo)準(zhǔn)品HER2-ECD構(gòu)建檢測(cè)血清中 HER2蛋白含量技術(shù)，并以此作為配對(duì)抗體親和力、特異性、穩(wěn)定性的檢測(cè)以及配對(duì)抗體濃度、反應(yīng)所需試劑和反應(yīng)條件的優(yōu)化等。（3）收集合肥地區(qū)的乳腺癌患者的血清標(biāo)本

5、，使用研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并與西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司的類似試劑盒對(duì)比實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用student?s t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)。
　　結(jié)果：
　　純度較高的抗HER2單克隆抗體HuA21和HerA由本實(shí)驗(yàn)制備成功。對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用的試劑盒各項(xiàng)組分進(jìn)行優(yōu)化，從而確定了高靈敏人血清 HER2檢測(cè)試劑盒的包被抗體和檢測(cè)抗體抗分別為HuA21和生物素標(biāo)記的HerA。由上述方法所建立的ELISA方法檢測(cè)靈敏度為7

6、.8 pg/ml，檢測(cè)范圍為0-500 pg/ml，其批內(nèi)變異系數(shù)為0.2%～10.9%，批間變異系數(shù)為1.4%～12.4%，在人血清中的抗原回收率在86.84%～116.40%之間，與上海西門子公司的化學(xué)發(fā)光法試劑盒測(cè)定臨床血清HER2含量相比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者之間的差異無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且其兩者之間的相關(guān)性(R2>0.70)具有明顯的一致性。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)成功研制了一項(xiàng)能夠檢測(cè)人血清中 HE

7、R2含量的高靈敏試劑盒。通過(guò)檢測(cè)收集到的臨床血清樣品發(fā)現(xiàn)，通過(guò) HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者與早期乳腺癌患者及健康人的比較可知，其血清中 HER2含量明顯高于早期患者及健康者的平均水平(P<0.05)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) HER2在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的檢出陽(yáng)性率為37.5%，這基本符合國(guó)外報(bào)道的結(jié)果。通過(guò)使用本實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)臨床組織樣品的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，血清 HER2在 HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的含量明顯高于早期乳腺癌患者及健康人的平均