定量檢測人超敏C-反應蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立及初步臨床應用.pdf

1、背景： C—反應蛋白(CRP)是一種高度保守的血漿蛋白，在脊椎動物和多種非脊椎動物中存在同系物，參與全身炎癥反應。機體處于炎癥狀態(tài)時，其血漿CRP濃度升高，因此CRP作為炎癥標記物被廣泛應用于臨床。CRP是一種模式識別分子，通常與死亡細胞或病原體表面的特殊分子構型結合。在組織損傷或感染后數小時內，其合成迅速增加，提示CRP參與機體的宿主防御和固有免疫反應。最近，血漿CRP水平的輕微升高和未來心血管事件的相關性被廣泛證實。因此，建

2、立高靈敏度的CRP測定方法是一項重要的實用性研究領域，引起研究工作者和臨床醫(yī)生的興趣和關注。 目的： 初步建立一種可用于檢測人超敏C—反應蛋白(hs—CRP)的雙抗體夾心ELISA方法，并初步探討其臨床應用價值。 方法： 1．采用ProteinA親和層析柱純化本室制備的抗CRP單克隆抗體(mAb)，并行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)和蛋白印跡(Western—blot)對純化抗體特性進行鑒定；利用

3、簡易過碘酸鈉法對抗CRPmAb進行辣根過氧化物酶(HRP)標記。 2．采用dp—AminophenylphosphorylCholnieGel親和層析柱從腫瘤患者胸水中分離、純化CRP，并通過SDS—PAGE與Western—blot檢測其純度與特異性。 3．通過抗體配對實驗確定最佳配對抗體，行方陣滴定法確定包被抗體和酶標抗體的最適工作濃度；以純化的CRP抗原為標準品建立標準曲線；以重復性、靈敏性、回收性實驗評價ELIS

4、A方法。 4．對冠狀動脈無狹窄者(冠脈正常組)68例、狹窄直徑＜50％者(冠狀動脈硬化癥組)59例和狹窄直徑≥50％者(冠心病組)67例采用雙抗體夾心ELISA方法測定血漿hs—CRP水平。 5．統(tǒng)計學方法：采用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計分析。Hs—CRP數據呈非正態(tài)分布，以中位數(M)和四分位數間距(QR)表示。非正態(tài)分布資料多組間比較用Kruskal—Wallis檢驗，兩兩比較用Mann—Whitney檢驗。

5、 結果： 1．采用proteinA親和層析柱從小鼠腹水中純化出55KD、25KD各一條帶，SDS—PAGE檢測純度超過95％的蛋白，行western—blot檢測未見雜帶。并行HRP酶標，酶標抗體行western—blot檢測未見雜帶。 2．采用dp—AminophenylphosphorylCholnieGel親和層析法從腫瘤患者胸水中成功純化出大小為24KD蛋白，SDS—PAGE檢測純度超過95％，用抗CRPmA

6、b進行western—blot檢測未見雜帶。 3．最佳配對組合為抗CRPmAb1C10和HRP標記抗CRPmAb2C11，最適工作濃度分別為10ug/ml和1：2000，該方法的批內、批間變異系數分別為3.1％～9.7％和3.6～13.6％，靈敏度達8.3ng/ml，回收率為90％～109％。 4．用ELISA法測定的血漿hs—CRP水平：冠狀動脈硬化癥組明顯高于冠脈正常組[(1.15±3.65mg/L)vs(0.74±