基于實時PCR的多靶檢測技術(shù)研究.pdf

1、作為重要的均相檢測技術(shù)，實時PCR因具有快速、簡便、靈敏、特異、可定量等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。然而，受目前實時PCR儀可檢測的熒光通道數(shù)目的限制，實時PCR存在檢測容量小的問題，難以在單次反應(yīng)中檢測多個靶序列。針對這個問題，本論文對實時PCR多靶檢測技術(shù)展開了研究，研究工作主要包括對多色組合探針編碼技術(shù)的研究及探針熔解曲線分析技術(shù)的研究。 第一部分，提出了多色組合探針編碼技術(shù)，并考察了該技術(shù)分別用于

2、多靶識別和多突變檢測的可行性。在該部分第一章，以多種食源性致病菌為檢測對象，利用改良分子信標作為檢測探針，將多色組合探針編碼技術(shù)用于八種食源性致病菌的識別，所建立的檢測體系可以準確識別八種食源性致病菌的任意一種，具有快速、簡便、通量高、特異性好等優(yōu)點。第二章，詳細考察了熒光雙鏈置換探針受Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性的影響及其規(guī)律，為多色組合探針編碼技術(shù)用于多種突變的檢測打下基礎(chǔ)。第三章，以β-珠蛋白基因多種突變?yōu)闄z測對

3、象，通過結(jié)合HAND系統(tǒng)和熒光雙鏈置換探針技術(shù)，將多色組合探針編碼技術(shù)用于多種突變的檢測，在單個反應(yīng)管中實現(xiàn)對5種中國常見β-地中海貧血突變的檢測和21種基因型的分型。 第二部分，發(fā)展了新的探針熔解曲線分析技術(shù)。多色熒光檢測和Tm多重檢測是實現(xiàn)實時PCR多靶檢測的有力工具。然而，目前的熒光探針具有難以同時結(jié)合多色熒光檢測和Tm多重檢測的缺陷。因此，在該部分第一章，首先系統(tǒng)考察了目前常用的熒光探針用于熔解曲線分析的可行性，比較各探