基于Taqman探針和染料相結(jié)合的液滴數(shù)字PCR用于PIK3CA基因E545K三種基因型的檢測(cè).pdf

1、目的:針對(duì)目前實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)和液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)只能檢測(cè)已知突變位點(diǎn)的不足，嘗試建立一種基于Taqman探針和染料相結(jié)合的ddPCR方法用于檢測(cè)未知突變序列，并應(yīng)用該方法檢測(cè)PIK3CA基因E545K突變位點(diǎn)的三種基因型（野生型、雜合突變型和純合突變型）。
　　方法:本研究屬于方法學(xué)研究，即先建立方法，然后與已有方法

2、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，確定方法的可靠性。
　　1.選擇包含PIK3CA基因的野生型（MCF-7細(xì)胞）和雜合突變型（H460細(xì)胞）細(xì)胞系以及合成包含PIK3CA基因的純合突變型雙鏈DNA，針對(duì)PIK3CA基因E545K突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物及一對(duì)野生型(FAM標(biāo)記)和突變型（VIC標(biāo)記）探針。
　　2.提取各細(xì)胞系的核酸，PCR擴(kuò)增后測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物，確定各細(xì)胞系包含的PIK3CA基因E545K位點(diǎn)的基因型。
　　3.實(shí)時(shí)

3、定量PCR檢測(cè)引物和探針的特異性，初步建立基于Taqman探針和DNA結(jié)合染料(EvaGreen)聯(lián)合使用的qPCR反應(yīng)體系，并優(yōu)化反應(yīng)體系，使三種基因型純樣本之間的qPCR終熒光信號(hào)值差別最大，從而便于對(duì)三種基因型純樣本進(jìn)行鑒別區(qū)分。
　　4.理論上qPCR反應(yīng)體系可以直接應(yīng)用于ddPCR，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)體系的某些條件進(jìn)行微調(diào)，然后以qPCR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，應(yīng)用ddPCR建立和優(yōu)化雙探針?lè)ǎㄒ吧?突變型）與野生型探針聯(lián)合

4、EvaGreen染料的方法，用于PIK3CA基因E545K突變位點(diǎn)三種基因型的檢測(cè)，確保能夠從ddPCR結(jié)果圖中清晰的區(qū)分不同基因型的液滴團(tuán)。
　　5.應(yīng)用上述兩種ddPCR方法對(duì)同時(shí)含有三種基因型的混合樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，分別得到三種基因型的拷貝數(shù)，對(duì)三組數(shù)據(jù)分別做配對(duì)樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，通過(guò)P值判斷兩種檢測(cè)方法所得到的結(jié)果的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，驗(yàn)證方法的可靠性。
　　結(jié)果:1.由染料法qPCR優(yōu)化體系及PCR循環(huán)條件，得

5、到最佳退火溫度為62℃，此時(shí)體系擴(kuò)增效率（amplification efficiency，E）E=0.9181。良好的擴(kuò)增效率可降低ddPCR中各液滴之間因擴(kuò)增效率不同導(dǎo)致的熒光信號(hào)差異和結(jié)果的不準(zhǔn)確。
　　2.采用qPCR雙探針體系分別檢測(cè)三種基因型純樣本，由擴(kuò)增曲線可知探針特異性良好。
　　3.初步建立了聯(lián)合使用野生型探針和EvaGreen染料的qPCR體系，分別對(duì)等拷貝數(shù)的三種基因型純樣本進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，優(yōu)化后各樣本間

6、野生型探針(VIC)信號(hào)差值最大。
　　4.基于ddPCR建立的雙探針?lè)w系，經(jīng)優(yōu)化可用于檢測(cè)同時(shí)含有三種基因型的混合樣本，包含不同基因型的液滴團(tuán)可清晰區(qū)分。
　　5.基于ddPCR建立的聯(lián)合使用野生型探針和EvaGreen染料的體系，優(yōu)化后也可檢測(cè)同時(shí)包含三種基因型的混合樣本，各基因型對(duì)應(yīng)的液滴團(tuán)清晰可分。
　　6.應(yīng)用ddPCR的雙探針?lè)ê吐?lián)合使用野生型探針和EvaGreen染料兩種方法分別對(duì)同一組含有三種基因型的

7、混合樣本進(jìn)行檢測(cè)，分別得到三種基因型的拷貝數(shù)，分別對(duì)三組樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。野生型組:P=0.954＞0.05;雜合突變型組:P=0.451＞0.05;純合突變型組:P=0.308＞0.05，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:成功建立了基于ddPCR聯(lián)合使用TaqMan探針和染料檢測(cè)PIK3CA基因E545K突變位點(diǎn)三種基因型的方法。該方法只使用野生型探針，可檢測(cè)與此野生型探針序列不匹配的任何SNP或其他