慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默PIK3CA基因?qū)β殉采掀ば园┘?xì)胞株SKOV3增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建靶向人PIK3CA(P110α)基因的RNAi慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染人卵巢上皮性癌細(xì)胞株SKOV3。應(yīng)用Real-time PCR檢測PIK3CA基因沉默效果；MTT檢測感染慢病毒后SKOV3細(xì)胞增殖能力的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測慢病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。初步探討慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默PIK3CA基因在卵巢癌基因治療中的應(yīng)用前景，以開辟治療卵巢癌的新途徑。 方法： 1. 首先進(jìn)行PIK3CA基因RNA

2、i靶點設(shè)計：根據(jù)基本設(shè)計原則再結(jié)合RNAi效率預(yù)測公式，篩選出4條理論上最佳的siRNA序列，同時選擇一個陰性對照靶點。將設(shè)計好的siRNA序列編碼成shRNA框架，化學(xué)合成5個靶點的DNA片段。 2. HpaⅠ和XhoⅠ酶切pGCL-GFP載體以使其線性化。 3. 將合成的DNA雙鏈直接連入酶切后的pGCL-GFP載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆后送測序。 4. 從大腸桿菌中提取陽性克

3、隆pGCL-GFP-PIK3CA。 5. XhoⅠ和SacⅡ酶切真核表達(dá)載體pEGFP-C1使其線性化。通過PCR從含有PIK3CA片段的質(zhì)粒克隆模板中提取PIK3CA片段，并用XhoⅠ和SacⅡ?qū)ζ溥M(jìn)行酶切。 6. 將PIK3CA片段酶切產(chǎn)物與酶切后的真核表達(dá)載體pEGFP-C1連接，PCR鑒定陽性克隆并送測序。 7. 將融合蛋白pEGFP-C1-PIK3CA用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)

4、胞，36-48 h后在熒光顯微鏡下通過觀察融合蛋白GFP/RFP的表達(dá)情況，顯示PIK3CA基因是否正確表達(dá)。 8. 將敲減質(zhì)粒pGCL-GFP-PIK3CA和表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-PIK3CA以不同比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過Western Blot檢測PIK3CA基因的表達(dá)水平，篩選出RNA干擾的最有效靶點。 9. 分別提取重組慢病毒載體pGCL-GFP-PIK3CA、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0(gag/po

5、l元件)載體和Helper 2.0(VSVG元件)載體三質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其進(jìn)行濃縮，得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中應(yīng)用逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度，4 d后觀察熒光表達(dá)情況，得到病毒原液的滴度值。 10. 將病毒原液感染生長狀態(tài)良好的SKOV3細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，感染3 d后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。感染5 d后收

6、集細(xì)胞，采用Real-time PCR方法檢測PIK3CA基因mRNA表達(dá)情況。 11. 將CON組(未加病毒組)、NC組(加RNAi病毒組)、KD組(加陰性對照病毒組)三組細(xì)胞分別接種于96孔板，每種細(xì)胞5個復(fù)孔，MTT檢測其第1、2、3 d自然生長情況。 12. 將CON組、NC組、KD組三組細(xì)胞分別接種于6孔板，5 d后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測。 結(jié)果： 1. 針對PIK3CA

7、設(shè)計了4個RNAi靶點，選擇了一個陰性對照靶點，并構(gòu)建了病毒載體框架，退火形成雙鏈DNA oligo，經(jīng)12％非變性PAGE凝膠電泳檢測雙鏈退火正確。 2. Hpa I和Xho I酶切pGCL-GFP載體以使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示酶切成功。 3. siRNA直接連入酶切成功后的pGCL-GFP載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定了克隆轉(zhuǎn)化結(jié)果，并挑選出陽性克隆psc1-1、psc2-1、ps

8、c3-1、psc4-1、pscNC-1菌液送Invitrogen公司進(jìn)行ABI3730型測序儀進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果顯示連接正確。 4. 將陽性克隆質(zhì)粒抽提獲得質(zhì)粒pGCL-GFP-PIK3CA。 5. Xho Ⅰ和Sac Ⅱ酶切pEGFP-C1載體使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示酶切成功。提取的PIK3CA片段及酶切后的PIK3CA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示正確。 6. 酶切后的PIK3CA片成功連接入酶切后的

9、真核表達(dá)載體pEGFP-C1，通過PCR鑒定了陽性克隆，陽性克隆送測序顯示PIK3CA基因克隆正確。 7. 融合蛋白pEGFP-C1-PIK3CA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示PIK3CA正確表達(dá)。 8. 敲減質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，WesternBlot檢測PIK3CA表達(dá)水平結(jié)果顯示3＃即psc340靶點對PIK3CA有敲減作用。 9. 將重組慢病毒載體pGCL-GFP-PIK3CA、包

10、裝質(zhì)粒pHelper 1.0(gag/pol元件)載體和Helper 2.0(VSVG元件)載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收獲病毒并測定病毒滴度為2x108TU/ml。 10. Real-time PCR檢測慢病毒感染SKOV3后PIK3CA沉默效果。 KD組PIK3CA基因相對含量為0.3303，明顯低于CON組(1.1087)和NC組(1.1087)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CON組和NC組間PIK3CA

11、基因相對表達(dá)量無差別(P>0.05)。擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線顯示，擴(kuò)增途中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。提示RNA干擾PIK3CA基因表達(dá)后，基因得到了穩(wěn)定、長期抑制。 11. MTT法檢測細(xì)胞生長狀況 CON 組及NC組細(xì)胞體外生長速度無明顯差異(P>0.05)，生長趨勢基本一致，而KD組細(xì)胞生長速度明顯慢于CON及NC組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。可見抑制

12、PIK3CA基因表達(dá)的細(xì)胞生長速度明顯減慢。提示PIK3CA基因的表達(dá)受抑制對SKOV3細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。 12. 流式細(xì)胞儀檢測自發(fā)凋亡率和細(xì)胞周期的變化 三組細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測，KD組凋亡率為3.877％明顯高于對照組CON組0.95％和NC組0.693％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KD組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯少于CON和NC組，S期細(xì)胞數(shù)明顯大于CON和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05

13、)。而CON和NC組凋亡率和細(xì)胞周期無差異(P>0.05)。提示慢病毒感染SKOV3后通過降調(diào)PIK3CA表達(dá)，使細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)比例增加，可能是使細(xì)胞周期阻滯于S期。 結(jié)論： 1. 慢病毒可能是攜帶siRNA進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞的理想載體。 2. RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，PIK3CA在mRNA及蛋白水平被顯著、持久沉默。 3. PIK3CA基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3的生長和增殖有明顯的調(diào)