4-HPR聯(lián)合DDP對卵巢癌細胞株SKOV3增殖抑制作用的實驗研究.pdf

1、第一部分：4-HPR聯(lián)合DDP對卵巢癌細胞株增殖抑制作用的體外實驗研究
　　 目的:4-羥苯基維胺脂(N-4-hydroxyphenylretinode，4-HPR)是一種全反式維甲酸的衍生物，實驗研究和部分臨床實驗表明，它對各種腫瘤有化學預防和治療雙重作用;順鉑（cis-platin，DDP）是卵巢癌常用的化療藥物，但因其毒副作用及其耐藥等問題，臨床應用受到限制。本研究探討在體外環(huán)境下，4-羥苯基維胺酯(4-HPR)聯(lián)合順鉑(

2、DDP)對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖及凋亡的影響。
　　 方法:4-HPR單藥，DDP單藥及4-HPR+DDP聯(lián)合用藥方式多種劑量分別干預人卵巢癌細胞株SKOV-3;MTT法檢測SKOV-細胞增殖抑制率變化;中效原理法判斷聯(lián)合用藥的相互作用;HOCHST和流式細胞單染和雙染分析凋亡細胞比例。實驗結果計量資料以均數(shù)±標準差表示。應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果

3、:MTT檢測方法結果:
　　 1、兩種藥物單獨使用時均具有劑量依賴性和時間依賴性。
　　 2、DDP:藥物作用48小時，各相鄰藥物濃度組之間，只有DDP20μM與DDP10μM濃度組之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);藥物作用72小時，從DDP2.5μM濃度組開始均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計學差異。
　　 3、4-HPR:藥物作用48小時，各相鄰藥物濃度組之間，只有4-HPR20μM與4-HPR10μM濃度組之間有

4、統(tǒng)計學差異;藥物作用72小時，從4-HPR10μM至4-HPR20μM濃度組均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計學差異。
　　 4、兩種藥物聯(lián)合應用后，根據(jù)中效濃度的計算，除4-HPR1μM+DDP5μM在48h的聯(lián)合應用組外，在其余48h與72h的所有聯(lián)合應用組，均CI＜1，即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
　　 HOECHST檢測方法:
　　 1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細胞株72h后，兩種藥物單

5、獨使用時，均具有劑量依賴性。
　　 2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應用，根據(jù)中效濃度的計算，4-HPR5μM+DDP5μM組和4-HPR10μM+DDP5μM組均為CI＜1，即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
　　 流式雙染檢測法結果:
　　 1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細胞株72h后，兩種藥物單獨使用時均具有劑量依賴性。
　　 2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應用，根據(jù)中效濃度的計算，三組藥

6、物聯(lián)合應用組均為CI＜1，即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
　　 流式單染檢測法:
　　 1)DDP與4-HPR聯(lián)合應用組:DDP通過降低G1期細胞的比例，主要將細胞阻滯在G2期，抑制SKOV-3細胞的增殖，而4-HPR主要將細胞阻滯在S期和G2期。聯(lián)合應用兩種藥物的效果綜合了兩種藥物的單獨作用效果。
　　 結論:SKOV-3細胞在4-HPR5μM+DDP5μM和4-HPR10μM+DDP5μM聯(lián)合作用7

7、2h后，能夠產(chǎn)生明顯的抑制增殖的作用，且作用協(xié)同，其中4-HPR的使用濃度越高，抑制效應越明顯。
　　 第二部分：4-HPR聯(lián)合DDP對卵巢癌移植瘤增殖抑制作用的體內(nèi)實驗研究
　　 目的:建立人卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型，探討4-HPR和DDP單獨應用及聯(lián)合應用對移植瘤的作用，進一步探討其作用機制。
　　 方法:先培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKVO-3，用細胞懸液接種法制備荷瘤鼠模型1只;再用套管針組織塊接種法進行皮下接4

8、-HPR組種，共接種30只裸鼠;觀察成瘤情況;分組后腹腔分別給藥:(1)對照組:生理鹽水;(2)4-HPR組:8mg/kg;(3)順鉑組:3mg/kg;(4)聯(lián)合用藥組:4-HPR8mg/kg，4-HPR給藥6小時后給順鉑3mg/kg，均為腹腔注射給藥，一次注射劑量為0.2ml，每周兩次，共三周。每周測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，取瘤組織進行病理學檢查;免疫組織化學S-P法檢測瘤組織Caspase-3蛋白的表達;檢測

9、細胞凋亡率和細胞周期變化。
　　 結果:用2.5×1010個/只細胞懸液接種成功制備荷瘤鼠一只，套管針皮下接種SKVO-3瘤塊后，2～3天皮丘消平，約4～5天可見微小的腫瘤結節(jié)，接種成功率為100％。治療結束時測移植瘤體積分別為4937.72±563.28mm3、3726.34±462.32mm3、2687.78±631.91mm3、1532.69±723.84mm3，抑瘤率分別為0.00％、30.21％、42.78％、61.3

10、7％。移植瘤體積，各處理組均小于對照組，聯(lián)合用藥組小于單藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);腫瘤組織病理:剖視腫瘤，對照組大部分呈類圓形，有的腫瘤可見表面血管，顏色灰白，質(zhì)地較硬。光鏡下見，對照組腫瘤具有惡性腫瘤細胞的一般特性，還具有特征性的腺腔樣結構。實驗組見不同程度點、片狀壞死，并有炎性細胞的浸潤，以聯(lián)合用藥組最重。免疫組織化學法檢測Caspase-3的變化，對照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組，結果用免疫組化評分(HIS

11、)分別為:2.78±1.33、4.15±0.76、5.22±0.62、6.37±1.25，各組與對照組相比，聯(lián)合用藥組與單藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。流式細胞術結果顯示:對照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組，細胞凋亡率逐漸升高，分別為6.43±2.31％、14.75±4.32％、21.54±1.47％、25.76±3.42％，細胞周期G0/G1期細胞逐漸減少，G2/M期細胞逐漸增多，S期細胞變化不明顯。
　　

12、 結論:4-HPR對SKVO-3細胞的增殖抑制作用呈時間-劑量依賴關系，4-HPR與順鉑聯(lián)合應用可增強順鉑對SKVO-3細胞的增殖抑制作用。4-HPR可抑制SKVO-3細胞裸鼠移植瘤的生長，4-HPR與順鉑聯(lián)合應用抑瘤效果增強。4-HPR可使SKVO-3細胞，細胞周期阻滯于G2/M期，誘導其凋亡，4-HPR與順鉑聯(lián)合應用誘導SKVO-3細胞凋亡作用增強。4-HPR可通過增加Caspase-3蛋白的表達，增強SKVO-3細胞對順鉑的敏感