下調(diào)ALKBH2基因?qū)δI癌細胞株ACHN增殖的抑制作用研究.pdf

1、腎細胞癌是發(fā)生于腎臟實質(zhì)腎小管的人類常見腫瘤。此類腫瘤在人癌癥中占約為3％至2%。此類腫瘤的發(fā)病率僅位居膀胱腫瘤之后,在中國的發(fā)病率逐年上升，死亡率也逐年上升；原發(fā)性腎癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時往往已失去手術(shù)時機，盡管采取積極手術(shù)減瘤治療，及免疫治療，但療效欠佳。對中晚期腎癌，近期應(yīng)用舒尼替尼等生物學(xué)治療，雖可延長生存期，但大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因此，進一步探討腎癌的發(fā)展和惡性特征的腎細胞癌與基因的功能變化之間的關(guān)系，可幫助揭示其

2、分子機制，藥物的合理設(shè)計和預(yù)判RCC的發(fā)生和發(fā)展，對RCC的醫(yī)治尤其關(guān)鍵。
　　表觀遺傳學(xué)，例如組蛋白修飾以及DNA烷基化等對于腫瘤的研究具有指導(dǎo)作用。運用表觀遺傳學(xué)的原理，可調(diào)控特異性的基因變化，為診療腎腫瘤提供了可能。表觀遺傳學(xué)在癌細胞有非常復(fù)雜的內(nèi)涵，DNA烷基化是人類癌細胞中最常見的遺傳改變，經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)觸媒反應(yīng)，DNA的兩個核苷酸C、G胞嘧啶可烷基化為5

3、-甲基胞嘧啶。DNA烷甲基化的H3K9以及H4K20等與轉(zhuǎn)錄下調(diào)有相關(guān)性。DNA烷基化與癌癥多階段的發(fā)病相關(guān)，也與慢性感染或炎癥相關(guān)。RCC具有大量的烷基化基因。Arai等報道，甲基化程度越低的患者腎腫瘤分期越早。Arai等對BAC-array的甲基化的研究結(jié)果進一步提示了DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性。組蛋白修飾也介入了腎多種細胞癌的生長及轉(zhuǎn)移。因組蛋白的烷基化靶點不一致,對遺傳物質(zhì)起激活或下調(diào)作用。組蛋白磷酸化和DNA損傷修復(fù)及轉(zhuǎn)錄

4、調(diào)節(jié)等有關(guān)。
　　ALKBH蛋白質(zhì)家族高表達于各種人類癌癥，涉及到腫瘤的生長及發(fā)展。人類AlkB存在多個ALKBH基因的亞型，其個別異構(gòu)體和泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)展之間的關(guān)系是未知的，特別是涉及到腫瘤從非侵入性轉(zhuǎn)化為侵入性的進展的分子機制，有待深入研究。ALKBH2為其中的一個亞型，在膀胱腫瘤中與癌蛋白-粘蛋白1（MUC1）分子有關(guān)，調(diào)節(jié)細胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其基因水平上調(diào)可導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌,在泌尿系腫瘤中具有重要的地位。

5、　　ALKBH2基因是大腸桿菌AlkB基因的同源物，現(xiàn)在被稱為雙脫氧酶的蛋白的作用下，可以在1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶甲基化時催化氧化，去除烷基，從而使得損傷的DNA修復(fù)。其在腦腫瘤及膀胱腫瘤中有高表達的報道。有研究表明：在某些胃癌中，ALKBH2是可能通過抑制胃癌細胞的增殖，參與了胃癌的分子機制。共同采取cDDP及調(diào)低ALKBH2的表達可提高非小細胞性肺癌的預(yù)后。研究該基-2-因產(chǎn)物在腎腫瘤中的作用，包括腎腫瘤的生存、凋亡、對細胞

6、周期的影響、對腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移方面的作用，具有一定的臨床意義。也可以研究是否可作為一種腫瘤標(biāo)志物用于臨床檢查和醫(yī)治。
　　目的：
　　為了研究ALKB2蛋白在腎癌中的作用，選取代表性的人腎癌（renal cell carcinoma RCC）細胞株ACHN和人正常腎小管上皮細胞HKC，檢測ALKB2的表達水平，以期發(fā)現(xiàn)表達差異。發(fā)現(xiàn)表達差異后，利用RNAi技術(shù)設(shè)計并篩選出ALKBH2基因敲減效果最優(yōu)的shRNA序列。構(gòu)建人源A

7、LKBH2基因shRNA干擾慢病毒表達載體進行鑒定并利用慢病毒來作為shRNA序列的高效載體，侵染人腎癌細胞株ACHN，構(gòu)建ALKBH2基因敲減細胞模型。利用前期構(gòu)建好的ALKBH2基因敲減慢病毒，構(gòu)建體外細胞模型。探索ALKBH2基因被敲減后，ACHN在細胞增殖和凋亡等方面的功能變化以觀察其功能。
　　方法：
　　培養(yǎng)ACHN和HKC之后利用Western blot和qRT-PCR技術(shù)，分別從蛋白水平和基因水平檢測α-酮戊

8、二酸依賴的雙加氧酶AlkB同源體2(ALKB2)的表達。使用EGFP慢病毒侵染人腎癌細胞株ACHN，驗證慢病毒侵染效率。構(gòu)建ALKBH2基因的高表達載體(pcDNA3.1-ALKBH2)分別與三個ALKBH2基因的shRNA載體共轉(zhuǎn)HEK293細胞。使用qRT-PCR技術(shù)測定篩選出干擾效果最優(yōu)的shRNA載體(shRNA-571)。使用最佳的shRNA序列的慢病毒載體的構(gòu)建，并包裝了慢病毒。使用包裝出來的慢病毒以適當(dāng)?shù)腗OI侵染人腎癌細

9、胞株ACHN，使用qRT-PCR技術(shù)驗證慢病毒的干擾效果。抑制人的腎癌ACHN細胞以ALKBH2慢病毒感染，分別使用細胞毒性/增殖測定試劑盒CCK-8和Annexin V-PE/7-AAD試劑盒檢測人腎癌細胞株ACHN的細胞增殖和細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　根據(jù)實測qRT-PCR的數(shù)據(jù)，按兩組樣本的平均△Ct值計算，ACHN組及HKC組的ALKBH2基因的相對表達量分別為8.73X10-3及6.55X10-4，ACHN細胞中

10、ALKBH2基因的表達水平約為人正常腎小管上皮細胞HKC中的13倍。以每個樣本的2-△Ct值為標(biāo)準(zhǔn)計算，差別在兩組之間的表現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。Western blot的數(shù)據(jù)也很好地印證了此結(jié)果。ACHN中ALKB2蛋白的相對表達量也大大高于HKC。EGFP慢病毒侵染ACHN細胞的MOI值測定結(jié)果顯示，MOI=10時，綜合分析ACHN細胞陽性比例(熒光率）較高、細胞狀態(tài)較好。shRNA對目的基因ALKBH2的干擾效率為：ShR

11、NA-571(84.7%）> ShRNA-662(84.6%）>ShRNA-468(63.1%），選擇對ALKBH2干擾效果最佳的ALKBH2-571構(gòu)建慢病毒載體及包裝慢病毒，PL/shRNA/F-ALKBH2-571轉(zhuǎn)染實驗48小時后，熒光顯微鏡下顯色效果滿意。病毒的滴度為1.1*108TU/ml。成功獲得ALKBH2基因敲減的ACHN細胞。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示ALKBH2基因敲減效率達到92.2%。人腎癌細胞株ACHN的ALKB

12、H2基因被敲減后，CCK-8細胞增殖-毒性實驗顯示ALKBH2-干擾組的吸光度值為0.4033，陰性對照組的吸光度值為0.8427，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01）。流式細胞測試結(jié)果顯示，ACHN細胞株經(jīng)shRNA-ALKBH2-571慢病毒侵染后，細胞晚期凋亡為26.457%，正常細胞為64.473%。兩者在細胞晚期凋亡有差異(P<0.05）。數(shù)據(jù)顯示人腎癌細胞株ACHN的ALKBH2基因被敲減后，表現(xiàn)出了明顯的細胞增殖受抑制