轉(zhuǎn)染RI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞HO-8910體外增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是一種酸性糖蛋白，分子量50KDa，能與RNaseA緊密結(jié)合抑制其對(duì)RNA的水解作用。血管生成因子(Ang)是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的具有強(qiáng)烈誘發(fā)血管生成活性的一種單鏈堿性蛋白質(zhì)，分子量 14.4KDa，是RNaseA超家族中的一員。Ang在組織細(xì)胞中分布廣泛，在腫瘤組織及正常組織中均有表達(dá)，提示其在體內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控。Ang的氨基酸殘基與RNaseA具有35﹪的同

2、源性，X射線分析表明它們有著及其相似的空間結(jié)構(gòu)，都可以作為配體與RI緊密結(jié)合，但Ang與RI有更大的親和力。被結(jié)合后的Ang便失去了促血管生成的活性，試驗(yàn)也證實(shí)RI能有效的阻斷血管生成因子誘導(dǎo)的血管生成，從而減緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，達(dá)到治療腫瘤的目的。 卵巢癌是一種實(shí)體腫瘤，在腫瘤間質(zhì)中存在著高密度的微血管，卵巢癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移與這些微血管相關(guān)。在惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的初始階段，沒(méi)有自身的血管系統(tǒng)，局部營(yíng)養(yǎng)主要靠效率很低的單純擴(kuò)散方式提

3、供，不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)1～2mm<'3>就需要新生血管維持營(yíng)養(yǎng)和氧氣供給從而迅速生長(zhǎng)并可發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤的新生毛細(xì)血管密度越高越有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此在惡性腫瘤發(fā)生時(shí)血管生成活躍，研究控制卵巢癌血管生成的方法對(duì)治療卵巢癌意義重大。 目前，雖然血管生成抑制劑治療卵巢癌已獲得肯定，但認(rèn)為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因療法將特定基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，使之持續(xù)表達(dá)從而達(dá)到持續(xù)抑制腫瘤血管生成的作用效果更顯著。基因治療在腫瘤領(lǐng)域的成功應(yīng)用為卵巢癌的

4、基因治療奠定了基礎(chǔ)，為治療卵巢癌展現(xiàn)了一個(gè)有希望的前景。 目的：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將RI基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞HO-8910，探討RI基因?qū)υ撃[瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。 方法： 1.將重組載體(plncx-RI)通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞。 2.用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞陽(yáng)性克隆。 3.用RT-PCR的方法鑒定細(xì)胞中的RI基因，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)細(xì)胞中RI

5、的表達(dá)。 4.通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)，MTT及流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析研究轉(zhuǎn)染RI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞HO-8910增殖的抑制作用。 結(jié)果： 1.用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HO-8910后用400ug/ml的G418篩選出陽(yáng)性克隆。 2.經(jīng)RT-PCR鑒定RI基因已經(jīng)整合進(jìn)HO-8910細(xì)胞基因組中。 3.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)出在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞RI基因在胞漿內(nèi)有高表達(dá)。 4