人白介素-18基因克隆及在卵巢癌HO-8910細胞中表達及對細胞增殖活性影響研究.pdf

1、目的：白細胞介素-18(interleuldn-18 IL-18)是一種新型的細胞因子，可以誘導(dǎo)T細胞、NK細胞產(chǎn)生干擾素-γ，促進T細胞增殖、增強細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞的活性，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。本實驗應(yīng)用分子生物學(xué)的方法克隆人IL-18(human terleuldn-18 hIL-18)基因，構(gòu)建人IL-18真核表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人卵巢癌HO-8910細胞，觀察hIL-18基因能否在人卵巢癌HO-8910細胞內(nèi)表達。

2、初步探討hIL-18對卵巢癌細胞生長增殖活性的影響，為制備卵巢癌基因工程腫瘤疫苗奠定實驗基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)Genbank登錄的IL-18序列用DNAstar軟件設(shè)計上下游引物，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從胎盤組織中克隆人IL-18基因，經(jīng)鑒定正確后，與pGEM-T載體連接，構(gòu)建pGEM-hIL-18質(zhì)粒。pGEM-hlL-18質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，測序分析后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，一挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基，3

3、7℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。重新設(shè)計引物，在上下游引物中分別引入SalI和EcoRI酶切位為點，以pGEM-hlL-18為模板進行PCR，PCR產(chǎn)物和pCI-neo真核表達載體分別進行雙酶切，構(gòu)建pCI-hIL-18重組質(zhì)粒。常規(guī)培養(yǎng)卵巢癌HO-8910細胞，將鑒定正確的pCI-hlL-18重組質(zhì)粒用Lofectamine2000介導(dǎo)法將人IL-18基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人卵巢癌細胞系HO-8910中，轉(zhuǎn)染分三組：空白組：卵巢癌HO-8910細胞+脂質(zhì)體

4、；對照組：卵巢癌HO-8910細胞株+pCI；實驗組：卵巢癌HO-8910細胞+pCI-hIL-18。用一定劑量的藥物篩選陽性克隆，挑取陽性克隆進行擴大培養(yǎng)。分別抽提三組轉(zhuǎn)染細胞的RNA用上述引物進行RT-PCR檢測，用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-18蛋白表達；用MTT法檢測轉(zhuǎn)染pCI-hlL-18重組質(zhì)粒的卵巢癌HO-8910細胞生長增殖能力的變化。 結(jié)果： 1.成功從人胎盤組織內(nèi)克隆出IL-18基因，大小為

5、605bp,包含有IL-18完整的ORF，經(jīng)測序分析與Genbank登錄(登錄號NM 001562)的IL-18序列完全一致。 2.成功構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pGEM-hIL-18和真核表達質(zhì)粒pCI-hIL-18。 3.重組表達質(zhì)粒pCI-hIL-18經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞，用RT-PCR和ELISA檢測分別在mRNA水平和蛋白水平獲得表達?？瞻捉M和對照組均未檢測到IL-18的表達。 4.轉(zhuǎn)染pCI-hIL-18