RNAi沉默G-,α13-表達(dá)及其對(duì)人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究.pdf

1、y926309I礬Ai沉默G棚表達(dá)及其對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究RNAinterferencesilencesGalpha13expressionandstudiesontheaffectsgrowthandmetastasisassociatedabilityofhumanovariancarcinomaH08910PMcells學(xué)科門(mén)類(lèi)醫(yī)學(xué)學(xué)科、專(zhuān)業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向年級(jí)研究生姓名導(dǎo)師姓名起

2、止日期基因治療與信息傳導(dǎo)二零零叁級(jí)曾振飛梁念慈教授劉新光教授20039—20066廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室二OO六年五月RNAi沉默GⅢ表達(dá)及其對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究摘要【目的】以RNA干擾(RNAi)㈣G。lj基因的表達(dá)觀(guān)察其對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力的影響，探索其作用機(jī)制為腫瘤治療提供新的策略?！痉絡(luò)；去】根據(jù)人GⅡ13基因序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)Tuschl等設(shè)計(jì)shRNA

3、的原則，確定Gb3干擾位點(diǎn)以ShuttleVector10CMV為載體，以定向克隆的方法構(gòu)建針對(duì)G。13的shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒：電泳法初步篩選正確的重組克隆；DNA測(cè)序驗(yàn)證重組克隆的正確性；重組質(zhì)粒與綠色熒光表達(dá)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞HO8910PM，熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效果；RTPCR檢測(cè)在mRNA水平對(duì)Gm表達(dá)的影響：Westernblot檢測(cè)在蛋白水平對(duì)G。13表達(dá)的影響。MTT法檢測(cè)G。13沉默后對(duì)人卵巢癌

4、HO8910PM細(xì)胞的增殖影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G。13沉默后對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞周期的影響及凋亡情況：Tmnswellchamber法檢測(cè)Gm沉默后對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞侵襲能力和趨化性運(yùn)動(dòng)能力的影響；細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G。13沉默后對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞粘附能力的影響；細(xì)胞骨架抽提術(shù)觀(guān)察G。13沉默后對(duì)細(xì)胞骨架的影響：放射自顯影法檢測(cè)GⅢ沉默后對(duì)Rho活性的影響?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了針對(duì)人G?！?四個(gè)不同位點(diǎn)

5、的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，能夠正常測(cè)序，并且測(cè)序結(jié)果證實(shí)了插入的轉(zhuǎn)錄模板完全正確；脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組shRNA表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比較高：與未處理組比較，RNAi可使GⅢ的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，其中針對(duì)B位點(diǎn)的RNAi作用效果最明顯；RNAi沉默G。13表達(dá)后對(duì)人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的增殖、侵襲與運(yùn)動(dòng)都具有一定程度的抑制作用，對(duì)細(xì)胞的粘附能力無(wú)明顯影響：RNAi作用后，阻斷細(xì)胞于S期，無(wú)凋亡峰；RNAi沉默Gnl3表達(dá)后能改變細(xì)胞