pGPU6-GFP-survivin-shRNA表達載體的構建及其對卵巢癌HO8910PM細胞凋亡作用的探討.pdf

1、背景與目的：近年來，人們對腫瘤的研究逐步向分子領域延伸，以期通過基因治療達到治愈腫瘤的目的。細胞凋亡調控的紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)，其中凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of apoptosis proteins，lAPs）是一個研究熱點。Survivin基因是IAPs中的一個新成員，具有抑制細胞凋亡和促進細胞增殖的活性，通過直接或間接抑制caspase3和caspase7活性等途徑阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡。RNA干擾（

2、RNAi）是當前應用在逆向遺傳學研究中高效的基因沉默技術，能高效特異地阻斷基因的表達。目前，有關siRNA沉默survivin基因對卵巢癌HO8910PM細胞凋亡作用的研究還鮮有報道。本實驗意在研究Survivin-shRNA對survivin的沉默效應在卵巢癌細胞HO8910PM中的作用，為卵巢癌基因治療奠定一定的基礎。 方法：研究對象為人卵巢癌HO8910PM細胞株。（1）設計并構建針對survivin的siRNA真核表達質

3、粒載體；（2）培養(yǎng)HO8910PM細胞，以脂質體法轉染細胞，設計空白對照組（Blank組）、陰性對照組（NC組，pGPU6-GFP-NC質粒轉染細胞）、轉染試劑對照組（MOCK組）、sur-shRNA組（pGPU6-GFP-survivin-shRNA質粒轉染細胞）；（3）實時熒光定量PCR檢測survivin mRAN表達水平；（4）流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期情況；（5）Western blot檢測survivin蛋白的表達量。

4、 結果：（1）重組質粒表達載體pGPU6-GFP-survivin-shRNA經酶切、測序鑒定，證實插入載體目的基因片段大小與插入方向正確；（2）通過脂質體介導轉染人卵巢癌HO8910PM細胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。（3）實時熒光定量PCR結果證實干擾組的HO-8910PM細胞在48h和72h survivin mRNA表達量下降了38％和57％，與blank組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05），48h到72h干擾片段的沉

5、默效應呈增強趨勢；（4）流式細胞術檢測，細胞的轉染率為52.26％，在48h和72h sur-shRNA組細胞凋亡率（30.78±0.68和38.47±0.84）高于Blank組（2.15±0.78和2.74±0.55）（P<0.05）； NC組（2.87±0.81和3.67±0.29），MOCK組（3.38±0.56和3.88±0.25）和Blank組比無差異（P<0.05）；（5）PI單染流式細胞儀檢測細胞周期結果證實sur-shR

6、NA組細胞周期發(fā)生改變，轉染后G0/G1期細胞數(shù)顯著增加，與Blank組相比出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期升高而G2/M期下降（P<0.05）。（6）Western blot結果證實了轉染pGPU6-GFP-survivin-shRNA的HO8910PM細胞survivin蛋白的量明顯下調。 結論：（1）針對survivin基因的pGPU6-GFP-survivin-shRNA表達載體構建成功。（2）針對survivin