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文檔簡介
1、背景與目的:近年來,人們對腫瘤的研究逐步向分子領域延伸,以期通過基因治療達到治愈腫瘤的目的。細胞凋亡調控的紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié),其中凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins,lAPs)是一個研究熱點。Survivin基因是IAPs中的一個新成員,具有抑制細胞凋亡和促進細胞增殖的活性,通過直接或間接抑制caspase3和caspase7活性等途徑阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡。RNA干擾(
2、RNAi)是當前應用在逆向遺傳學研究中高效的基因沉默技術,能高效特異地阻斷基因的表達。目前,有關siRNA沉默survivin基因對卵巢癌HO8910PM細胞凋亡作用的研究還鮮有報道。本實驗意在研究Survivin-shRNA對survivin的沉默效應在卵巢癌細胞HO8910PM中的作用,為卵巢癌基因治療奠定一定的基礎。 方法:研究對象為人卵巢癌HO8910PM細胞株。(1)設計并構建針對survivin的siRNA真核表達質
3、粒載體;(2)培養(yǎng)HO8910PM細胞,以脂質體法轉染細胞,設計空白對照組(Blank組)、陰性對照組(NC組,pGPU6-GFP-NC質粒轉染細胞)、轉染試劑對照組(MOCK組)、sur-shRNA組(pGPU6-GFP-survivin-shRNA質粒轉染細胞);(3)實時熒光定量PCR檢測survivin mRAN表達水平;(4)流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期情況;(5)Western blot檢測survivin蛋白的表達量。
4、 結果:(1)重組質粒表達載體pGPU6-GFP-survivin-shRNA經酶切、測序鑒定,證實插入載體目的基因片段大小與插入方向正確;(2)通過脂質體介導轉染人卵巢癌HO8910PM細胞,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。(3)實時熒光定量PCR結果證實干擾組的HO-8910PM細胞在48h和72h survivin mRNA表達量下降了38%和57%,與blank組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),48h到72h干擾片段的沉
5、默效應呈增強趨勢;(4)流式細胞術檢測,細胞的轉染率為52.26%,在48h和72h sur-shRNA組細胞凋亡率(30.78±0.68和38.47±0.84)高于Blank組(2.15±0.78和2.74±0.55)(P<0.05); NC組(2.87±0.81和3.67±0.29),MOCK組(3.38±0.56和3.88±0.25)和Blank組比無差異(P<0.05);(5)PI單染流式細胞儀檢測細胞周期結果證實sur-shR
6、NA組細胞周期發(fā)生改變,轉染后G0/G1期細胞數(shù)顯著增加,與Blank組相比出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象,G0/G1期升高而G2/M期下降(P<0.05)。(6)Western blot結果證實了轉染pGPU6-GFP-survivin-shRNA的HO8910PM細胞survivin蛋白的量明顯下調。 結論:(1)針對survivin基因的pGPU6-GFP-survivin-shRNA表達載體構建成功。(2)針對survivin
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