Survivin shRNA載體的構(gòu)建及其對(duì)大腸癌細(xì)胞體內(nèi)外作用的研究.pdf

1、背景和目的： 大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，在美國(guó)是導(dǎo)致惡性腫瘤死亡的第二大原因，且每年的發(fā)病人數(shù)達(dá)到135，000人。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌的發(fā)病率也逐年提高，發(fā)病率已占惡性腫瘤的第三位，嚴(yán)重威脅人類的健康。 目前絕大多數(shù)的大腸癌仍采取手術(shù)為主的綜合治療，隨著治療水平的提高，大腸癌的術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移逐步下降，但綜合治療的費(fèi)用較高，副作用多，局部復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移仍然是治

2、療失敗的主要原因，因此預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移，篩選高危患者，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以便及時(shí)治療，對(duì)提高患者的生存質(zhì)量和生存率具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，基因治療正成為腫瘤防治研究的重點(diǎn)。目前，腫瘤的基因治療方法主要有基因替代，反義核酸技術(shù)，細(xì)胞因子基因治療以及近年來(lái)最為關(guān)注的RNA干擾技術(shù)，腫瘤基因治療的關(guān)鍵是找到合適的靶基因以及應(yīng)用最先進(jìn)的基因治療手段。 Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的凋亡抑制

3、蛋白(1AP)家族的新成員，在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，近年研究發(fā)現(xiàn)Survivin在正常大腸上皮細(xì)胞中不表達(dá)而在大腸癌中高表達(dá)，Survivin的表達(dá)上調(diào)與大腸癌的凋亡指數(shù)下降、總體存活率縮短、預(yù)后不良和復(fù)發(fā)率增加有關(guān)。鑒于它的獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)，Survivin有望成為腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)，許多研究顯示降低它的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，對(duì)腫瘤的治療有利。RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)，它主要通過(guò)核酸

4、酶將雙鏈RNA(dsKNA)切割成21-25nt的小干擾RNA，即siRNA，由siRNA按堿基配對(duì)的原則特異性的識(shí)別并切割同源性靶mRNA分子而實(shí)現(xiàn)。短發(fā)夾樣RNA(shorthairpinRNA,shRA)在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成siRNA，使基因沉默，且比siRNA作用更穩(wěn)定，高效.本研究構(gòu)建針對(duì)Survivin基因的特異性shRNA表達(dá)載體，探索針對(duì)Survivin基因的RNA干擾技術(shù)對(duì)大腸癌細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響，構(gòu)建裸鼠人大腸

5、癌動(dòng)物模型，觀察其在體內(nèi)對(duì)腫瘤的作用。 研究方法： 1、針對(duì)Survivin基因的一段靶序列：GGCTGGCTTCATCCACTGC(86-104)采用GeneChemTMsiRNA的設(shè)計(jì)工具，參照siRNA的設(shè)計(jì)原則，利用含綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pGCsi-H1/Neo/GFP，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。兩條寡核苷酸經(jīng)退火、限制性內(nèi)切酶Hind和BamH1雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定陽(yáng)性克隆、構(gòu)建pGCH1/Surviv

6、inshRNA表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。 2、培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞系SW480(Survivin高表達(dá))，用非脂質(zhì)體法將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SW480，并應(yīng)用硫酸鹽G418進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)染后以流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、透射電鏡、Western-blot方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)染和細(xì)胞周期及Survivin蛋白的表達(dá)情況。 3、MTT法測(cè)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的增殖情況。 4、Transwell小室法測(cè)定對(duì)細(xì)胞遷移能力

7、的影響。 5、將SW480細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pGCH1/SurvivinshRNA的SW480細(xì)胞分別接種裸鼠皮下，建立裸鼠人大腸癌荷瘤模型，觀察shRNA-Survivin對(duì)成瘤性的影響。 6、采用雙盲法定期測(cè)量皮下腫瘤結(jié)節(jié)的二維值，計(jì)算每個(gè)腫瘤的體積和各組平均體積變化的差值，計(jì)算腫瘤抑制率。 7、免疫組織化學(xué)法測(cè)定Survivin蛋白的表達(dá)情況。 8、TUNEL法和透射電鏡檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。 9、

8、顯微鏡下觀察肝，腎，肺等組織變化并測(cè)定血常規(guī)，了解siRNA對(duì)裸鼠血液系統(tǒng)，肝，腎，肺等器官的影響。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin，經(jīng)測(cè)序顯示重組質(zhì)粒shRNA編碼序列與我們?cè)O(shè)計(jì)的靶向Survivin的核苷酸序列完全一致。 2、綠色熒光蛋白載體構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，G418篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上，流式細(xì)

9、胞儀分析和透射電鏡顯示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞周期的變化(G2/M期增高)和凋亡的出現(xiàn)(細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)聚集，核內(nèi)呈團(tuán)塊狀，可見凋亡小體)。Western-blot分析轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)受到抑制，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Survivin蛋白的表達(dá)分別被下調(diào)了52.1％、73.6％、45.8％、41.7％，抑制的時(shí)間較長(zhǎng)。 3、MTT測(cè)定顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后細(xì)胞的

10、增殖受到抑制。 4、Transwell小室法分析細(xì)胞的遷移能力顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后的SW480細(xì)胞遷移能力較未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的SW480細(xì)胞明顯下降，抑制率為44.08％。 5、接種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裸鼠成瘤能力較未轉(zhuǎn)染的裸鼠成瘤能力降低，成瘤時(shí)間延長(zhǎng)，瘤結(jié)節(jié)的體積小，抑瘤率為67.86％。 6、免疫組化測(cè)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的裸鼠移植瘤Survivin的表達(dá)降低，TUNEL法和

11、透射電鏡顯示凋亡增加，凋亡指數(shù)(17.25±3.30)％vs(5.48±1.38)％，(P<0.05)。 7、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的安全性分析顯示，轉(zhuǎn)染后的裸鼠與未轉(zhuǎn)染組重要臟器的結(jié)構(gòu)和功能以及血液系統(tǒng)都未受到影響。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin. 2、靶向Survivin的shRNA表達(dá)載體可以較長(zhǎng)時(shí)間抑制Survivin蛋白的表達(dá)；抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞

12、的凋亡，改變了細(xì)胞周期。 3、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的SW480細(xì)胞遷移能力明顯下降，說(shuō)明Survivin除了抗凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用外，還可能參與和影響了腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程，降低Survivin的表達(dá)還可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。 4、SW480細(xì)胞可成功在裸鼠身上建立大腸癌模型。 5、事先轉(zhuǎn)染特異的shRNA-Survivin的大腸癌SW480細(xì)胞成瘤性差，重組質(zhì)粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin.能抑制大腸