抗癌蛋白AC-01對大腸癌細胞的影響及其機制研究.pdf

1、本實驗期望通過體內和體外實驗，深入探討抗癌蛋白AC-01對大腸腫瘤細胞生物學特性所產生的影響，以及產生該影響的生物機制，為AC-01應用于大腸癌的生物治療提供實驗證據(jù)。
　　第一部分人大腸癌細胞中AC-01的表達及其與STAT3的關系
　　目的:
　　臨床收集人大腸癌標本，研究AC-01在大腸癌中的表達及作用。
　　方法:
　　在前期研究基礎提示STAT3為促癌基因的基礎上，首先利用前期所制備的多克隆抗體，

2、首先對該蛋白在大腸組織內的表達特征進行了觀察，免疫組化技術檢測AC-01在大腸組織中的分布及表達。臨床收集人大腸癌組織標本，標本分為八組，每組分腫瘤與癌旁組織，應用Western blot法檢測八組中AC-01及STAT3、pSTAT3的蛋白表達并進行比較。
　　結果:
　　免疫組化技術檢測AC-01在大腸組織中的分布及表達，結果提示AC-01蛋白在人的正常大腸組織存在表達。人大腸癌組織標本中，腫瘤組織中AC-01蛋白表達低

3、于癌旁組織。
　　結論:
　　本實驗研究表明:①人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達水平低于正常組織;②人大腸腫瘤中STAT3、pSTAT3蛋白表達水平均高于正常組織。③人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達水平與pSTAT3蛋白表達水平為負相關，存在統(tǒng)計學意義。綜合以上，根據(jù)STAT3為促癌基因的前期研究結果，由此推測AC-01為抗癌蛋白。
　　第二部分構建并鑒定載體及穩(wěn)定細胞株
　　實驗一 構建靶向AC-01的過表達載體及

4、shRNA表達載體
　　目的:
　　體外培養(yǎng)人結腸癌LOVO細胞株，提取質粒，構建過表達pBabe-puro-AC-01載體，同時設計并構建以AC-01為靶基因的pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體，最終構建穩(wěn)定細胞株。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人結腸癌LOVO細胞株，根據(jù)NCBI提供的AC-01基因序列(NCBI登錄號為XM006714717)進行分析，以攜帶AC-01基因的質粒為模板

5、，通過PCR擴增出AC-01基因的編碼序列，構建了pBabe-puro-AC-01過表達載體。
　　結果:
　　所得質粒經酶切鑒定及測序鑒定，證實了干擾質粒中含有目的基因的序列，重組質粒構建成功。
　　實驗二 構建穩(wěn)定細胞株并鑒定
　　目的:
　　篩選最高效序列AC-01/RNAi，逆轉錄病毒載體轉染LOVO細胞株，篩選保留穩(wěn)定細胞株，鑒定穩(wěn)定細胞株并檢測AC-01基因表達。
　　方法:
　　使

6、用脂質體法將pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體轉染人結腸癌LOVO細胞系，轉染細胞分為4組，分析轉染后的效果。
　　結果:
　　結合柱狀圖顯示AC-01/RNAi-1組的AC-01蛋白表達最低，因此認為AC-01/RNAi-1組序列效果最佳,LOVO-AC-01組的AC-01蛋白表達升高，LOVO-AC-01/RNAi組的AC-01蛋白表達降低。
　　結論:
　　成功構建過表達pBab

7、e-puro-AC-01載體及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體，篩選得到最高效序列AC-01/RNAi-1質粒，最終構建穩(wěn)定細胞株，并成功驗證。
　　第三部分AC-01對大腸癌細胞生物學特性的影響
　　目的:
　　探討AC-01對人結腸癌LOVO細胞增殖、分化、凋亡及侵襲性的影響。
　　方法:
　　將AC-01質粒及AC-01/RNAi-1質粒通過逆轉錄病毒轉染LOVO細胞，分

8、為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組。
　　結果:
　　AC-01質粒及AC-01/RNAi-1質粒成功通過逆轉錄病毒轉染LOVO細胞，分為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組，
　?、偌す夤簿劢褂^察轉染AC-01陽性細胞，與周圍對照細胞相比，細胞核顯著減小;AC-01轉染細

9、胞表現(xiàn)為分化具有更多的突起，隨AC-01重組蛋白濃度的增加，大腸癌細胞系LoVo細胞計數(shù)顯著下降。
　?、贛TT法檢測結果表明:四組中OD平均值有顯著性差異(H=12.12，P=0.007)，其相對增殖率亦有顯著性差異(H=12.00，P=0.0074)。根據(jù)細胞生長趨勢圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO細胞增殖強度及速度均減弱，而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO細胞增殖強度及速度均增強;
　?、矍忠u實驗結果表

10、明:四組中侵襲細胞數(shù)有顯著性差異(H=9.5848，P=0.0224＜0.05)。根據(jù)柱狀圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO侵襲細胞數(shù)減少，而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO侵襲細胞數(shù)增加。
　　④劃痕實驗結果表明:LOVO-AC-01組的細胞愈合率則弱于其他三組，LOVO-AC-01/RNAi組的細胞愈合率強于其他三組。
　?、?D-Culture實驗結果顯示:LOVO-vector組及LOVO-scramb

11、le組中LOVO細胞變化不明顯，LOVO-AC-01組的LOVO細胞表面觸角明顯收縮，表面變得平滑，LOVO-AC-01/RNAi組的細胞表面觸角明顯延長、增多，表面變得更加凹凸不平。
　　結論:
　　本實驗研究表明:①AC-01蛋白可以特異性地抑制癌細胞的增殖及侵襲能力，同時促進癌細胞凋亡，且效果顯著;②通過特異性沉默AC-01基因表達，可以促進癌細胞增殖，增強其侵襲能力，且效果顯著;③AC-01對大腸癌細胞系LoVo細胞

12、增殖的抑制作用具有劑量依賴性。④AC-01蛋白是一種抗癌蛋白，可能成為大腸癌臨床不良預后的一種分子標志，甚至成為大腸癌治療的靶目標。
　　第四部分AC-01對大腸癌細胞的作用機制研究
　　目的:
　　探討AC-01通過調節(jié)大腸癌細胞內質網應激影響LOVO細胞的存活、腫瘤演進、血管形成及凋亡的機制。
　　方法:
　　由于該蛋白的分布特征，我們推測該蛋白的表達可能與大腸癌細胞的內質網應激有關。因此，我們利用經典

13、的衣霉素(Tunicamycin)誘導的內質網應激模型，對應激條件下該蛋白的表達特征進行了觀察，檢測AC-01蛋白及內質網應激標志物GRp78、GADD的表達，了解內質網應激與AC-01蛋白的關系。
　　結果:
　　Western-blot檢測結果提示:四組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達有顯著性差異(均P＜0.05)，根據(jù)柱狀圖顯示

14、LOVO-AC-01組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達均下調，而stat3、p-stat3表達增高;LOVO-AC-01/RNA組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達均增強，而stat3、p-stat3表達下降。
　　結論:
　　本實驗研究表明:①

15、AC-01蛋白與內質網應激相關，可能是抑制內質網應激的損傷保護性蛋白;②AC-01蛋白通過內質網應激影響UPR信號轉導通路（PERK-eIF2A通路、ATF6通路和IRE1-XBP1通路），從而影響大腸癌LOVO細胞的存活、腫瘤演進及凋亡機制。③AC-01進一步抑制stat3、p-stat3及其相關蛋白MMP2、MMP9，從而影響大腸癌LoVo細胞的增殖及腫瘤血管形成。
　　第五部分小鼠體內實驗驗證AC-01對大腸癌細胞的影響

16、r>　　目的:
　　通過動物實驗探討AC-01對大腸癌細胞的影響。
　　方法:
　　分為LOVO-vector接種、LOVO-AC-01接種、LOVO-scramble接種、LOVO-AC-01/RNAi接種組。脂質體法轉染chickenB-actin-RFP-NEO表達載體。裸鼠腫瘤細胞異種移植試驗:雄性BALB/c裸小鼠皮下注射接種目標細胞，10毫克/公斤，每三天1次。腫瘤體積由長度(L)×寬度(W)2×0.5計算

17、，用滑動卡尺測量和計算，自第七天后每三天記錄1次，40天后小鼠處以安樂死，腫瘤稱重，記錄數(shù)據(jù)。
　　結果:
　　隨著時間和組別對于腫瘤體積都是有影響的，這種影響有統(tǒng)計學意義(均P＜0.0001)，組別和時間有交互作用。四組間，腫瘤重量差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0295)。根據(jù)柱狀圖顯示，與對照組比較，LOVO-AC-01接種組中腫瘤生長速度下降，腫瘤的體積、重量均減少;而且LOVO-AC-01/RNAi接種組中腫瘤生長速度加