藤梨根提取物對大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:
　　 藤梨根是臨床常用的治療大腸腫瘤的中草藥，其抗腫瘤作用已經(jīng)為藥理學(xué)及分子學(xué)研究證實(shí)，但針對目前對大腸癌抗癌抑癌的作用機(jī)理、治療靶點(diǎn)等缺乏研究。為了明確藤梨根提取物對大腸癌細(xì)胞凋亡過程中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的影響及增殖抑制作用的效應(yīng)，據(jù)此了解藤梨根提取物對大腸癌細(xì)胞的抗癌抑瘤的部分作用機(jī)制與量效關(guān)系，開展本研究。
　　 研究方法:
　　 一、體外實(shí)驗(yàn)：采用醇提取工藝提取

2、藤梨根抗癌有效活性成分(簡稱EERAC)，分別配制成10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml、320μg/ml的制劑，將96孔LoVo培養(yǎng)板分成4個組，分別滴加上述不同濃度的EERAC。然后:(1)采用倒置顯微鏡觀察不同濃度EERAC對培養(yǎng)孔內(nèi)的LoVo細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響，并采用AO/EB和Hoechst33258二種熒光染色觀察細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)改變、核固縮、細(xì)胞膜皺縮，凋亡小體等;(2)采用MTT法檢測不同濃度EERAC對大

3、腸癌LoVo細(xì)胞的抑制作用;(3)采用瓊脂糖凝膠電泳法觀察不同濃度EERAC在體外實(shí)驗(yàn)組中對LoVo細(xì)胞的DNAladder的形成情況;(4)采用流式細(xì)胞儀測定不同濃度EERAC對LoVo細(xì)胞周期的影響;(5)采用免疫化學(xué)法(IHC)測定不同濃度EERAC對LoVo細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的蛋白表達(dá)變化;
　　 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立大腸癌細(xì)胞HT-29荷瘤裸鼠模型，觀察:(1)不同劑量（5、10、20

4、mg/kg）EERAC荷瘤裸鼠體重、種植瘤生長抑制作用、對血常規(guī)、肝功能和腎功能、免疫器官的影響;(2)并采用LDH釋放法測定不同劑量EERAC對裸鼠NK細(xì)胞的活性;(3)采用IHC法測定不同劑量EERAC在HT-29荷瘤裸鼠體內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的蛋白表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 一、體外實(shí)驗(yàn)
　　 (1)與空白組比較，在不同濃度的EERAC組，其LoVo細(xì)胞密度減低，增殖變慢

5、;細(xì)胞逐漸變大、變圓，細(xì)胞間接觸變松，胞漿中顆粒增多，空泡化，脫壁，細(xì)胞周圍碎片增多，熒光染色觀察可見細(xì)胞凋亡的特征學(xué)形態(tài)改變出現(xiàn)。
　　 (2)MTT法測定顯示，EERAC對LoVo細(xì)胞的最佳作用時間為72h，最大抑制率為79.48％;
　　 (3)瓊脂糖凝膠電泳法檢測顯示隨著實(shí)驗(yàn)藥物濃度的增高，DNA斷裂明顯增多，DNAladder在320μg/mL組表達(dá)最強(qiáng)。
　　 (4)滴加EERAC處理24h后，LoV

6、o細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期和G2/M期的細(xì)胞減少，凋亡率為6.8%、13.1%、18.2%和26.3%，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (5)EERAC作用LoVo細(xì)胞24后，Bcl-2表達(dá)明顯減弱，Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯增高，Bcl-2/Bax比值下降，其效應(yīng)與濃度相關(guān)。
　　 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　 (1)不同劑量的EERAC對HT-29移植瘤均有明顯的抑制作

7、用，各劑量組的抑瘤率為9.12%，20.13%,37.81%，與藥物濃度呈正比;不同劑量的EERAC對荷瘤裸鼠的WBC、脾臟指數(shù)等免疫指標(biāo)均有所增加，對肝腎功能無明顯影響。
　　 (2)不同劑量的EERAC均可使NK細(xì)胞活性度增加。
　　 (3)不同劑量的EERAC作用后，LoVo細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)減弱，Bax、Caspase-3表達(dá)水平增高，Bcl-2/Bax比值下降，其作用也呈濃度相關(guān)性。
　　 研究結(jié)論:

8、
　　 1、EERAC對大腸癌LoVo細(xì)胞具有明顯抑制增殖作用，濃度越高、作用時間越長其抑制增殖作用越明顯;EERAC能阻滯癌細(xì)胞的在有絲分裂周期的S期增殖，能阻斷癌細(xì)胞DNA物質(zhì)的合成，高濃度時阻斷作用更明顯;
　　 2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，EERAC對大腸癌細(xì)胞或種植瘤具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且其作用強(qiáng)度與濃度或劑量呈正相關(guān)。其作用機(jī)制在于降低Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)Bax、Caspase-3表達(dá)水平，下調(diào)Bc

9、l-2/Bax比值。
　　 3、EERAC對機(jī)體的體重、血常規(guī)、肝腎功能無明顯影響，同時對機(jī)體的免疫功能有一定的增加作用。EERAC其抑痛作用雖差于5-Fu，但其對作用的HT-29荷瘤裸鼠的WBC、脾臟指數(shù)等體內(nèi)免疫指標(biāo)有提高作用;表明EERAC的抑瘤的同時，有助于提高機(jī)體免疫能力，且無5-Fu的明顯毒副作用。
　　 4、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，EERAC對大腸癌細(xì)胞的抑制作用與劑量有一定的相關(guān)性，高劑量組的療效較好，且無明顯毒副