黃荊子提取物VB1對人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機制的研究.pdf

1、第一章VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:
　　 探討VB1單藥和聯(lián)合5-FU用藥對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.建立人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)體系。
　　 2.用細(xì)胞增殖抑制實驗(MTT法)檢測細(xì)胞增殖:VB1單藥:0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μmol/L共7個濃度梯度，并選擇24，48，72h為3

2、個時間梯度;5-FU單藥:2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0μg/ml共7個濃度梯度，藥物作用時間48h;VB1聯(lián)合5-FU:將終濃度為5μmol/LVB1分別與不同濃度的5-FU共浴48h，對照組不加藥，檢測各組相對存活率，計算增殖抑制率。
　　 3.平板克隆形成實驗檢測不同藥物處理后各組的克隆形成率。
　　 4.不同藥物處理后，用Hoechst33258染色觀察凋亡形態(tài);流式細(xì)胞儀檢

3、測各組細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度的VB1(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μmol/L)分別作用JEG-3細(xì)胞后，結(jié)果顯示隨著VB1濃度和作用時間的增加，JEG-3細(xì)胞存活率減少（P＜0.05)。24h、48h、72小時的IC50分別為13.537、5.170、1.926μmol/L。
　　 2.48h時5-FU的IC50為25.257μg/ml，與5μmol/LV

4、B1合用時，IC50為4.078μg/ml，增效倍數(shù)為6.19倍。金氏公式計算q值均大于0.85，提示VB1與5-FU聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 3.不同濃度的VB1作用后，細(xì)胞的克隆形成率明顯低于對照組。藥物濃度越高，克隆形成率越低。VB1聯(lián)合5-FU用藥組的克隆形成率低于兩種藥物各自單獨用藥的克隆形成率(P＜0.05)。
　　 4.Hoehest33258染色觀察不同濃度的藥物作用JEG-3細(xì)胞后，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡

5、的多種形態(tài)改變;流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，各用藥組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.05)。VB1單獨作用JEG-3細(xì)胞，凋亡率與藥物的濃度正相關(guān)(P＜0.05)。VB1(5μmol/L)與5-FU(25μg/ml)聯(lián)合用藥組的凋亡率與相同濃度的單獨用藥組相比均明顯增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.VB1在一定的濃度范圍內(nèi)，可以明顯抑制JEG-3絨癌細(xì)胞的增殖，作用效果是劑量-時間依賴的。
　　

6、2.VB1在一定的濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)JEG-3絨癌細(xì)胞的凋亡，呈劑量依賴性。
　　 3.VB1與5-FU合用對JEG-3絨癌細(xì)胞的抗腫瘤效果是協(xié)同增強的。
　　 第二章VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的機制的研究
　　 目的:
　　 初步探討VB1對人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3抑制增殖和促進(jìn)凋亡可能的機制。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR檢測各濃度組AKT、mTOR、P

7、70S6K的mRNA的表達(dá)情況。
　　 2.Westernblot檢測各濃度組AKT、mTOR、P70S6K及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.Westernblot檢測各濃度組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度VB1作用JEG-3細(xì)胞后AKT、mTOR、P70S6KmRNA的相對表達(dá)量均比對照組明顯降低;并且在一定程度上呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。
　　 2.W

8、esternblot結(jié)果顯示隨著VB1作用濃度的升高，JEG-3細(xì)胞的AKT、mTOR、P70S6K及相應(yīng)磷酸化蛋白的相對表達(dá)量均比對照組降低，不同濃度組各指標(biāo)差異均具有顯著性（P＜0.05）。
　　 3.隨著VB1作用濃度的升高，JEG-3細(xì)胞的pro-caspase-3的表達(dá)無明顯變化，而cleaved-caspase-3逐漸增強，Bcl-2的表達(dá)則逐漸減弱，與對照組比較，差別具有顯著性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論

9、:
　　 VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞的抑制作用與mTOR信號通路相關(guān)，Caspase-3和Bcl-2家族的凋亡相關(guān)蛋白參與了VB1誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的過程。
　　 第三章VB1對絨癌抗腫瘤作用的動物實驗研究
　　 目的:
　　 建立人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞SCID鼠移植瘤模型，研究VB1單獨及聯(lián)合5-FU對荷瘤小鼠移植瘤的作用，并初步觀察其毒副反應(yīng)。
　　 方法:
　　 1.建立

10、人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞SCID鼠移植瘤模型，觀察腫瘤模型的生物學(xué)特性。
　　 2.用VB1單獨及聯(lián)合5-FU作用荷瘤小鼠后，觀察測量小鼠腫瘤體積、重量的變化，檢測血清β-HCG水平的變化;并通過檢測血白細(xì)胞計數(shù)、骨髓涂片、肝酶變化、體重改變以了解其毒副反應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立人絨毛膜癌SCID小鼠移植瘤模型，移植瘤接種成功率為100％，成瘤均勻一致。
　　 2.VB1對人絨毛膜癌荷瘤SC

11、ID小鼠的的腫瘤生長有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其體積抑瘤率、瘤重抑瘤率均明顯增加(P＜0.05)。VB1的高濃度組(80mg/kg)體積抑瘤率為76.65％，重量抑瘤率為46.56％。
　　 3.VB1聯(lián)合5-FU用藥組的體積抑瘤率和瘤重抑瘤率均比二者分別單獨作用時明顯增加(P＜0.05)，說明在動物模型體內(nèi)，VB1可增強5-FU的抑瘤作用。
　　 4.用藥后各組的血清β-HCG水平均明顯低于對照組，P＜0.

12、05。VB1用藥組β-HCG下降程度與藥物濃度正相關(guān)，聯(lián)合用藥組β-HCG水平低于兩藥單獨用藥組，具有顯著性差異，(P＜0.05)。
　　 5.各用藥組的外周血白細(xì)胞計數(shù)、血清ALT和AST結(jié)果與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，提示VB1短期內(nèi)對荷瘤小鼠的骨髓抑制作用、肝損害均不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.VB1對人絨毛膜癌JEG-3SCID小鼠皮下移植瘤的生長有明顯的抑制作用。
　　 2.VB