阻斷磷脂酶C-γ1信號通路對大腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其信號機制初步探討.pdf

1、大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，死亡率位居惡性腫瘤死亡譜的第4或第5位。然而，大腸癌治療效果卻不盡理想，約有半數(shù)患者治療失敗。因此，如何有效地干預、阻斷大腸癌的發(fā)生發(fā)展就成為亟待解決的問題。其中，尋找大腸癌的發(fā)病環(huán)節(jié)與靶點是研究的一個主要方面。蛋白質(zhì)及相關(guān)的信號通路異常與大腸癌的發(fā)生有著重要關(guān)系，表現(xiàn)為一些與細胞生長、分裂和增殖有關(guān)的信號傳導通路處于異?；罨癄顟B(tài)，而一些凋亡通路則往往傳遞信號受阻。大腸癌發(fā)生中信號傳導通路的研究不僅為大腸癌發(fā)

2、病機制的研究拓寬了視野，同時也為大腸癌的治療提供了更多的靶點選擇。 磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)是肌醇磷脂特異的磷脂酶C(PLC)家族中的一員，是跨膜信號傳導中關(guān)鍵和重要的一個信號中介。在受激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子等的受體或其它分子激活后催化水解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成兩個重要的第二信使二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，分別激活蛋白激酶C(PKC)及引起細胞內(nèi)Ca2+釋放，從而啟動下游一系列級聯(lián)反應，在分泌、

3、細胞增殖、細胞生長及分化等一系列細胞生理功能中發(fā)揮重要作用。關(guān)于PLC-γ1在細胞增殖中的作用有兩種截然不同的認識，在有些實驗模型中，發(fā)現(xiàn)它是調(diào)節(jié)細胞分裂與增殖的一個重要的分子，依賴其磷脂酶活性通過DAG的生成、激活蛋白激酶C(PKC)，進而活化ERK信號通路，或通過核轉(zhuǎn)位進而激活核內(nèi)PI3K信號途徑這兩方面促進細胞的分裂與增殖；在另外一些實驗模型中則發(fā)現(xiàn)PLC-γ1對于細胞的分裂、增殖并不起作用。PLC-γ1也是一個重要的凋亡負調(diào)控分

4、子，對于許多情況下細胞的存活是必需的。PLC-γ1與大腸癌的發(fā)生也有著重要關(guān)系，與正常組織相比，腺瘤和結(jié)腸癌組織中的PLC-γ1表達水平明顯增高，同時伴隨著其酶活性的升高，PLC-γ1與細胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生有著重要聯(lián)系，對腫瘤細胞的侵襲能力也有重要影響。熱休克蛋白70(HSP70)是熱休克蛋白家族的一員，是一種重要的分子伴侶，在細胞增殖與細胞凋亡的調(diào)控中同樣發(fā)揮重要作用，在大腸癌中也呈高表達狀態(tài)。大腸癌細胞中高表達的PLC-γ1是否與

5、其過度增殖狀態(tài)和凋亡失活狀態(tài)有關(guān)系?阻斷PLC-γ1信號通路能否抑制大腸癌細胞的過度增殖和啟動大腸癌細胞的凋亡?HSP70和PLC-γ1信號系統(tǒng)是否有聯(lián)系，對大腸癌細胞增殖和凋亡有何影響?目前尚未有研究回答這些問題。 本課題以大腸癌LOVO細胞株為研究模型，通過阻斷PLC-γ1信號通路，研究其對大腸癌細胞的增殖和凋亡的影響，并初步探討這些影響的可能信號機制，從而為研究大腸癌的發(fā)病機制及尋找新的治療靶點提供細胞與分子生物學依據(jù)。根

6、據(jù)實驗目的，本文的實驗可分為以下兩個部分： 一、阻斷PLC-γ1信號通路對大腸癌LOVO細胞增殖、生長特性的影響及信號機制初步探討 方法：以人大腸癌細胞株LOVO細胞作為研究模型，利用化學阻斷劑U73122阻斷LOVO細胞的PLC-γ1信號通路后，從以下幾個方面研究阻斷PLC-γ1信號通路后對LOVO細胞的影響：1.對LOVO細胞增殖的影響：作常規(guī)生長曲線，MTT法測定其細胞增殖抑制率；2.對LOVO細胞細胞周期進行的影

7、響：流式細胞儀檢測分析細胞周期各時相的細胞比例；3.對LOVO細胞生長特性的影響：光學顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)，集落形成實驗；4.對LOVO細胞中熱休克蛋白70(HSP70)表達的影響：免疫印跡(Westernblot)檢測HSP70的表達水平。 結(jié)果：1.阻斷PLC-γ1信號通路能大大降低LOVO細胞的貼壁能力，表現(xiàn)在光鏡下圓形細胞增多，而貼壁良好的梭形細胞減少，掃描電鏡下細胞的突起變短變細，細胞表面的微絨毛減少；2.PL

8、C-γ1信號通路被阻斷后使得LOVO細胞的增殖速度減慢，細胞增殖抑制明顯，并且表現(xiàn)出濃度依賴性，10μmol/LU73122作用24、48h后其抑制效果可分別達到35％和45％；3.阻斷PLC-γ1信號通路降低了LOVO細胞的集落形成能力，1μmol/LU73122作用即能使LOVO細胞的集落形成數(shù)減少一半左右，10μmol/LU73122作用時，則幾乎沒有細胞集落的形成；4.阻斷PLC-γ1信號通路能增加LOVO細胞G1期細胞比例，降

9、低S期細胞比例，從而抑制其細胞周期的進行；5.阻斷PLC-γ1信號通路后，LOVO細胞中的熱休克蛋白70(HSP70)的表達水平明顯增高。 討論：研究發(fā)現(xiàn)阻斷PLC-γ1信號通路后能夠抑制LOVO細胞的過度增殖，說明PLC-γ1是維持大腸癌細胞過度增殖的一個重要分子，也支持了PLC-γ1在細胞增殖調(diào)控中的重要作用。我們認為阻斷PLC-γ1信號通路能夠抑制大腸癌細胞的過度增殖應該和其本身過度表達PLC-γ1有關(guān)，對于同樣過度表達P

10、LC-γ1的乳腺癌等其它腫瘤細胞的增殖，我們推測PLC-γ1可能發(fā)揮同樣重要的作用。LOVO細胞PLC-γ1信號通路被阻斷后其G1期細胞比例降低而S期細胞比例增加，說明這種細胞增殖被抑制的機制之一是使LOVO細胞受阻于G1期，延緩細胞從G1期向S期的過渡，即通過抑制細胞周期的進行而實現(xiàn)。阻斷PLC-γ1信號通路后LOVO細胞中HSP70表達增加，說明有可能通過HSP70的分子伴侶作用與調(diào)控細胞周期進行的某些關(guān)鍵分子結(jié)合，穩(wěn)定其構(gòu)象，激活

11、或抑制它們的活性，從而抑制LOVO細胞細胞周期的進行。通過抑制異?；罨男盘柾穪碇委煷竽c癌的策略具有良好的應用前景。我們推測PLC-γ1有希望成為大腸癌治療中的一個新的靶點。 二、阻斷PLC-γ1信號通路對大腸癌LOVO細胞凋亡的影響方法：以人大腸癌細胞株LOVO細胞作為研究模型，利用化學阻斷劑U73122阻斷LOVO細胞的PLC-γ1信號通路后，從以下幾個方面研究阻斷PLC-γ1信號通路后對LOVO細胞凋亡的影響：1.光學顯

12、微鏡觀察細胞形態(tài)變化；2.瓊脂糖凝膠電泳分析；3.PI單染的流式細胞儀檢測；4.凋亡執(zhí)行蛋白Capspase-3檢測：免疫印跡(Westernblot)。 結(jié)果：阻斷PLC-γ1信號通路后發(fā)現(xiàn)1.雖然多數(shù)LOVO細胞鏡下表現(xiàn)圓形樣改變，但并未見凋亡特征性的皺縮樣變，同時臺盼藍染色檢測沒有發(fā)現(xiàn)死亡細胞增多，細胞活力沒有改變；2.瓊脂糖凝膠電泳未檢測到凋亡特征性的DNA片斷化梯狀帶；3.PI單染的流式細胞儀檢測也未有凋亡特征性的亞二

13、倍體峰的出現(xiàn)；4.免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)Caspase-3的前體表達量沒有變化，即沒有Caspase-3的激活。 討論：阻斷PLC-γ1信號通路后，未檢測到凋亡特征性的形態(tài)和生化特征的變化，同時也未有凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活，說明阻斷PLC-γ1信號通路不能啟動大腸癌細胞凋亡，PLC-γ1不是調(diào)控大腸癌細胞凋亡的關(guān)鍵信號分子。我們推測阻斷PLC-γ1信號通路不能啟動大腸癌細胞凋亡的可能原因是其它信號通路的代償活化，比如HS

14、P70表達增加的抗凋亡效應。阻斷PLC-γ1信號通路有可能降低大腸癌細胞的抗凋亡能力。 結(jié)論：一、阻斷PLC-γ1信號通路能夠抑制大腸癌LOVO細胞的過度增殖、改變其生長特性，這種細胞增殖抑制的機制之一是使LOVO細胞受阻于G1期，延緩細胞從G1期向S期的過渡即抑制細胞周期的進行而實現(xiàn)；阻斷PLC-γ1信號通路可上調(diào)HSP70的表達水平，HSP70的分子伴侶作用可能是其抑制大腸癌細胞周期進行的機制；PLC-γ1和HSP70都是調(diào)

15、控大腸癌細胞增殖、細胞周期進行的重要分子，HSP70可能是PLC-γ1信號途徑的下游信號分子。 二、阻斷PLC-γ1信號通路不能夠啟動大腸癌細胞的凋亡，PLC-γ1不是調(diào)控大腸癌細胞凋亡的關(guān)鍵信號分子，HSP70的表達增高對于維持大腸癌細胞的凋亡抑制狀態(tài)可能有一定作用。 大腸癌發(fā)生發(fā)展中涉及許多信號傳導通路的異常，大腸癌細胞增殖、凋亡的失控是許多信號通路交互作用的結(jié)果，PLC-γ1信號通路與這些異常的信號通路之間到底有何