抑制Hedgehog信號通路對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、皮膚鱗狀細胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC）的發(fā)病率有逐年增高趨勢，但其病因及具體發(fā)病機制尚未完全闡明，近年的資料表明可能與下列因素有關：1、紫外線輻射；2、人乳頭瘤病毒(HPV)；3、化學致癌物質(zhì)的接觸；4、癌前期皮膚病及免疫抑制劑的應用；5、其他皮膚?。郝詽?、燒傷或外傷性瘢痕等；6、熱損傷。目前SCC的治療多為非特異性療法，并不針對腫瘤自身的發(fā)病特點，所以不良反應較常見。因此，開發(fā)新型的、針對腫瘤特定

2、發(fā)病機制的治療更具前景，也引起國內(nèi)外皮膚界學者的廣泛關注。
　　Hedgehog（Hh）信號通路是近年來倍受關注的一個調(diào)控胚胎發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導途徑。研究表明，Hh信號通路在基底細胞癌（Basal cell carcinoma，BCC）等多種腫瘤的發(fā)病及治療中起著重要作用。Cyclopamine（環(huán)杷明）是Hh通路的特異性抑制劑，它可以特異性抑制該通路的活性，已成為一種潛在的抗腫瘤藥物。既往研究和我們的初步工作發(fā)現(xiàn)SCC的發(fā)生、發(fā)展與

3、Hh通路的異常激活有關。為進一步明確Hh信號通路在SCC發(fā)病和治療中的作用，本課題以五種人SCC細胞系為研究對象，體外觀察cyclopamine特異性抑制Hh信號通路對SCC細胞增殖、凋亡及其細胞周期的影響。
　　目的：
　　探討cyclopamine特異性抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路對人SCC細胞增殖及凋亡的影響。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)五種人SCC細胞株，經(jīng)cyclopamine處理后，分別采用MTT法

4、測定cyclopamine對SCC細胞增殖的抑制作用，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，采用流式細胞儀PI染色法檢測cyclopamine對SCC細胞周期分布的影響，并用流式細胞儀Annexin-V-FITC/PI雙重標記法檢測細胞凋亡的變化。
　　結果：
　　1、Cyclopamine抑制Hh通路對SCC細胞的形態(tài)學影響
　　體外常規(guī)培養(yǎng)五種鱗癌細胞系A431、Sa3、HSQ-89、Tca、HSC-2，在倒置相差顯微鏡下觀察細

5、胞形態(tài)變化及生長情況。五種細胞均呈貼壁生長，鏡下觀察結果顯示：空白對照組和陰性對照組的細胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰；與對照組細胞形態(tài)比較，cyclopamine組細胞生長緩慢，立體感消失，細胞內(nèi)顆粒增多，胞質(zhì)皺縮，核固縮現(xiàn)象明顯，細胞變小變圓，輪廓變模糊。形態(tài)學結果表明cyclopamine作用后的各SCC細胞系生長受到抑制，形態(tài)受損。
　　2、Cyclopamine對SCC細胞增殖的抑制作用
　　MTT比色法檢測不同濃度（依次為

6、：0.5、1、2、5μmol/L）cyclopamine對鱗癌細胞生長的劑量效應影響，結果表明cyclopamine能劑量依賴性地抑制五種鱗癌細胞的生長，其中以5μM濃度時抑制作用最為明顯。選取5μMcyclopamine作用于培養(yǎng)的細胞5～8天，檢測其抑制鱗癌細胞生長的時間效應。結果表明cyclopamine對各SCC細胞系的增殖抑制也具有時間依賴性。
　　3、Cyclopamine對SCC細胞的凋亡誘導作用
　　選取5μ

7、Mcyclopamine作用于SCC細胞48h，采用Annexin-V-FITC/PI雙重染色，流式細胞儀檢測凋亡率的變化。結果顯示，除HSQ-89細胞的凋亡率未檢測到明顯改變外，cyclopamine組的A431、Sa3、Tca、HSC-2四種細胞凋亡率（早期+晚期凋亡率）均較空白對照組明顯增加（P<0.05）。結果表明cyclopamine能夠明顯誘導SCC細胞發(fā)生凋亡，對不同的SCC細胞系，其凋亡誘導作用不同。
　　4、Cy

8、clopamine對SCC細胞的周期阻滯作用
　　5μMcyclopamine作用于SCC細胞48h，PI染色后流式細胞儀檢測cyclopamine對SCC細胞周期分布的影響。結果顯示：Tca細胞的實驗組G2/M期細胞較空白對照組明顯增多，A431、Sa3、HSC-2三種細胞的實驗組G0/G1期細胞較空白對照組明顯增多，G1期前出現(xiàn)較對照組更為明顯的亞二倍體峰；HSQ-89的細胞實驗組與對照組未檢測到明顯差別。結果表明：Cyclo