siRNA抑制ZNF139對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，目前對(duì)胃癌的治療措施是以手術(shù)為主導(dǎo)的綜合治療。但由于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖及抗凋亡能力且進(jìn)展迅速，故目前對(duì)胃癌的治療結(jié)果還遠(yuǎn)不能令人滿意。因此，尋找影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的新基因有重要意義。鋅指蛋白（zincfingerproteins，ZNFs）家族成員作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，很多成員與惡性腫瘤的增殖、凋亡有關(guān)。鋅指蛋白139(zincfingerprotein139，ZNF

2、139)是本研究所前期發(fā)現(xiàn)與胃癌關(guān)系密切的因子，但其是否能調(diào)節(jié)胃癌增殖凋亡未見(jiàn)報(bào)道。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是通過(guò)抑制顯性突變致癌基因的表達(dá)、擴(kuò)增、易位而成為從反面研究目的基因功能的一種有效方法。本實(shí)驗(yàn)以人工合成質(zhì)粒ZNF139-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901，采用四氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定各處理組胃癌細(xì)胞活力，繪制轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞的時(shí)間-劑量曲線;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周

3、期變化;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)ZNF139、CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2在各處理組中的表達(dá)情況，從而探討其在胃癌增殖、凋亡調(diào)控中發(fā)揮的作用及機(jī)制。
　　 方法:以人胃癌細(xì)胞株SGC7901為研究對(duì)象，人工合成質(zhì)粒介導(dǎo)的ZNF139-siRNA及非特異性siRNA載體。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(SGC7901)、實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染ZNF139-siRNA-Ps1的SGC7901）、陰性對(duì)照組

4、（轉(zhuǎn)染ZNF139-siRNA-PC的SGC7901）。首先以不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，MTT法測(cè)定不同劑量siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力，繪制胃癌細(xì)胞的時(shí)間-劑量曲線，以得到siRNA干擾的最適時(shí)間和劑量。用此條件轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后得到SGC7901/ZNF139-siRNA細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定3組細(xì)胞不同時(shí)間的凋亡率及細(xì)胞周期變化。最后分別提取各組細(xì)胞總mRNA，RT-PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞內(nèi)ZNF139、Cycl

5、inD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2mRNA表達(dá)情況，最后應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析、Spearman相關(guān)等分析其表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1三組凋亡率及細(xì)胞周期變化
　　 1.1各組凋亡情況比較
　　 流式細(xì)胞術(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組在ZNF139-siRNA-Ps1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC790124h、48h、72h后，均出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡率分別為(4.823±0.685％，

6、16.827±3.507％，20.107±3.305％)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組未見(jiàn)凋亡峰出現(xiàn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組3個(gè)不同處理時(shí)間凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001），空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.202，P=0.904)。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組不同處理時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(24h:t=-8.826P=0.012,48h:t=-7.505P=0.016,72h:t=-9.425P=0.008)。
　　 1.2各組

7、細(xì)胞的細(xì)胞周期分布比較
　　 在處理24小時(shí)，三組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.388，P=0.867)。
　　 處理48小時(shí)三組細(xì)胞的周期發(fā)生改變F=3.519，P=0.052，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.010），其細(xì)胞比例（62.100±1.908％），S期細(xì)胞減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)，其細(xì)胞比例(25.767±0.851％);G2/M期細(xì)胞數(shù)改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.81

8、1);三組細(xì)胞增殖指數(shù)分別為(48.033±1.563％，37.867±2.108％，47.36±2.3447％);實(shí)驗(yàn)組G0/G1期和S期與空白對(duì)照組有明顯差異(t=-7.253P=0.002，t=6.480P=0.003)。
　　 處理72小時(shí)三組細(xì)胞的周期亦有明顯差異F=5.900，P=0.013，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加(P=0.008)，其比例為(60.100±3.365％)，S期細(xì)胞減少(P=0.006)，其比例

9、為（28.767±1.234％）;G2/M期細(xì)胞數(shù)改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.238）;三組細(xì)胞增殖指數(shù)分別為(48.500±1.153％，39.900±365％，47.734±1.704％);實(shí)驗(yàn)組G0/G1期和S期與空白對(duì)照組有明顯差異(t=-4.188P=0.014，t=3.483P=0.025)。
　　 1.3各組細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較
　　 構(gòu)建的ZNF139-siRNA質(zhì)粒通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率約90％左右

10、，且ZNF139-siRNA-Ps1對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，0.8μg/ml質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)為最適條件。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后抑制率約為(22.21％,46.48％,45.81％);而ZNF139-siRNA-PC非特異性質(zhì)粒則不能沉默ZNF139的表達(dá)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后抑制率約為(8.64％，8.42％，1.08％)。
　　 2三組細(xì)胞中ZNF139、CyclinD1、PCNA、Cas

11、pase-3、Bcl-2mRNA的表達(dá)情況
　　 2.1空白對(duì)照組SGC7901與實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞中ZNF139、CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2mRNA均有表達(dá)。且在實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞中ZNF139、CyclinD1、PCNA、Bcl-2mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組SGC7901細(xì)胞，Caspase-3表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 2.2空白對(duì)照組SGC790

12、1與陰性對(duì)照組SGC7901細(xì)胞中ZNF139、CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2mRNA均有表達(dá)，且兩組細(xì)胞中各基因mRNA的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 3三組細(xì)胞中ZNF139與CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2mRNA表達(dá)的相關(guān)性
　　 3.1在空白對(duì)照組SGC7901細(xì)胞中ZNF139的表達(dá)與CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2

13、正相關(guān)(r=0.997P=0.048;r=0.998P=0.041;r=0.998P=0.041;r=0.997P=0.049)。
　　 3.2在實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞中ZNF139的表達(dá)與CyclinD1、PCNA、Bcl-2正相關(guān)（r=0.997P=0.049;r=0.997P=0.046;r=0.997P=0.045），與Caspase-3負(fù)相關(guān)(r=-0.998P=0.038)。
　　 3.3在陰性對(duì)照組SGC

14、7901細(xì)胞中ZNF139的表達(dá)與CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2正相關(guān)(r=0.997P=0.045;r=0.997P=0.049;r=0.9997P=0.016;r=0.998P=0.036)。
　　 結(jié)論:
　　 1對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC7901的研究證實(shí)，成功構(gòu)建的ZNF139-siRNA-Ps1質(zhì)粒能特異性沉默SGC7901細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子ZNF139表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

15、，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。
　　 2在轉(zhuǎn)染ZNF139-siRNA-Ps1質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞中總mRNA中CyclinD1、PCNA、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Caspase-3表達(dá)上調(diào);且ZNF139的表達(dá)與CyclinD1、PCNA、Bcl-2正相關(guān)，與Caspase-3負(fù)相關(guān)，表明轉(zhuǎn)錄因子ZNF139是通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2等相關(guān)因子共同完成胃癌細(xì)胞增殖凋亡基因調(diào)控過(guò)程