食管早期癌變過(guò)程中PIK3CA基因的擴(kuò)增及其意義.pdf

1、背景和目的：
　　食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球食管癌新發(fā)病例45.58萬(wàn)，死亡病例40多萬(wàn)。世界上70％的食管癌病例發(fā)生在我國(guó)，其中90％以上是食管鱗狀細(xì)胞癌，該腫瘤導(dǎo)致的死亡在我國(guó)排名第四位。食管癌早期癥狀不明顯，大部分患者就診時(shí)已到中、晚期，雖然手術(shù)模式不斷推陳致新，但是中晚期食管癌患者的5年生存率僅為10%左右。食管癌變是一個(gè)長(zhǎng)期的、多因素、多基因的復(fù)雜演變過(guò)程，目前關(guān)于食管鱗

2、狀細(xì)胞癌分子機(jī)制研究很多，如果在食管早期癌變過(guò)程中找到一種或幾種特異的分子標(biāo)記物，將有利于食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。PTEN/PIK3CA/AKT通路調(diào)控人類多個(gè)腫瘤的發(fā)生，其通路中關(guān)鍵的基因PIK3CA調(diào)控細(xì)胞的增殖、細(xì)胞存活、遷移，凋亡以及惡性轉(zhuǎn)化，在食管腫瘤里面已經(jīng)廣泛研究。但是目前缺乏食管早期上皮癌變過(guò)程中PIK3CA基因異常的研究。
　　本研究擬通過(guò)對(duì)食管早期上皮癌變過(guò)程中PIK3CA相對(duì)拷貝數(shù)和其蛋白表達(dá)水平的研究

3、，以期能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)用于早期食管癌前病變監(jiān)控和食管癌早期診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。
　　材料與方法：
　　材料：
　　1、收集2013-2014年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科59例術(shù)前未經(jīng)放、化療食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本，即42例完全配對(duì)新鮮標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR，包括癌組織(Carcinoma，CA)、異型增生(Dysplasia，D)，單純性增生(Hyperplasia，H)以及食管遠(yuǎn)端切緣黏膜下的肌肉組織(Muscle，M)作為對(duì)

4、照；和43例不完全配對(duì)石蠟切片（其中與新鮮組織重復(fù)取樣有26例配對(duì)標(biāo)本），CA（38例）、D(25例)、H(34例)、正常黏膜(Normal，N)(30例)，標(biāo)本均在癌、癌旁黏膜(距癌2 cm以內(nèi))及遠(yuǎn)端切緣黏膜(距癌5 cm外)取材，分別標(biāo)記為CA、P、Y。
　　2、正常食管黏膜上皮永生化細(xì)胞系NE3和食管癌細(xì)胞系EC109均由香港大學(xué)曹世華教授惠贈(zèng)。
　　方法：
　　1、HE染色：觀察食管癌以及食管癌旁黏膜及遠(yuǎn)端切

5、緣黏膜的組織學(xué)類型。
　　2、Quantitative PCR(q-PCR)：檢測(cè)顯微切割新鮮食管癌的M,H,D和CA中PIK3CA基因的擴(kuò)增情況；檢測(cè)NE3和EC109中PIK3CA基因擴(kuò)增情況。
　　3、免疫組織化學(xué)染色：采用Envision Labelled Peroxidase System(ELPS)二步法檢測(cè)石蠟組織切片中食管癌的N，H，D和CA中PIK3CA蛋白的表達(dá)情況；采用免疫熒光驗(yàn)證PIK3CA蛋白表達(dá)。

6、
　　4、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot,WB)：檢測(cè)新鮮食管癌的CA,P和N中PIK3CA蛋白的表達(dá)情況。
　　5、圖像采集：使用OLYMPUS BX43全能顯微鏡和OLYMPUS DP21圖像采集系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析。
　　6、統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。P值<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值<0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義。
　　結(jié)果：
　　1、q-PCR發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因相對(duì)拷貝數(shù)從正常肌肉組織到食管上皮早期癌變的單純性增生，異型增生，浸潤(rùn)癌組織中呈逐漸增高趨勢(shì)(rs=0.477，P<0.01)。
　　2、PIK3CA蛋白表達(dá)水平從食管癌的正常黏膜，異型增生到浸潤(rùn)癌組織中逐漸增高(P<0.01)。
　　3、癌細(xì)胞系比食管上皮永生化細(xì)胞系中的PIK3CA基因相對(duì)拷貝數(shù)有明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、PIK3C