潮汕食管癌變過程中BCL-6基因擴增的研究.pdf

1、背景和目的：食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。廣東省潮汕地區(qū)是中國食管癌發(fā)病帶之一。雖然治療水平在近年來已經(jīng)有長足進展，但是食管癌患者的5年生存率未見明顯提高。因此，加強對食管癌發(fā)病及演進機制的研究，提高早期食管癌的診斷率，改善其預后有重要的意義。本課題組早期采用比較基因組雜交技術(shù)（CGH），對三株 ESCC細胞系進行全基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）篩查，發(fā)現(xiàn)其中KYSE30、H5E973兩株細胞系均存在染色體3q26.3-qtel基因

2、組擴增現(xiàn)象。隨后在中國醫(yī)學科學院關(guān)于食管癌和癌旁石蠟組織的遺傳分析檢測報道中提及，3號染色體長臂為常見的擴增區(qū)域，而BCL-6基因正是位于該擴增熱點范圍內(nèi)。
　　縱觀位于染色體3q27.3的BCL-6基因的研究分析，絕大部分著重于探索BCL-6基因突變和染色體易位在淋巴瘤發(fā)生機制中的重要意義；而從一些實體腫瘤的研究結(jié)果中可觀察到，BCL-6以原癌基因角色介導調(diào)控與細胞增殖、分化、侵襲等相關(guān)基因的表達。然而，在BCL-6基因與食管癌

3、發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性探索里，除提及該基因位于高頻擴增的染色體區(qū)段，目前尚未發(fā)現(xiàn)有從DNA水平或蛋白質(zhì)水平對這一觀察結(jié)果進行驗證的報道。
　　本實驗將首次在新鮮食管癌及癌旁組織中驗證BCL-6基因擴增的情況；同時探究BCL-6基因擴增對自身蛋白表達的影響、BCL-6是否在DNA水平或/和蛋白水平參與到食管癌早期癌變過程中。
　　材料與方法：收集汕頭大學醫(yī)學院病理科2014年間術(shù)前未經(jīng)放化療的潮汕食管癌患者的手術(shù)標本共47例。標本均

4、在腫瘤、腫瘤旁粘膜和距腫瘤組織最遠處食管粘膜下肌肉等處配對取材，所有取材樣本平均分成兩組放入Ep管和石蠟包埋盒，并做好記錄。樣本保存方式：Ep管組織立即放置-80℃冰箱存放；包埋盒組織經(jīng)中性福爾馬林固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋保存。
　　1.HE染色：石蠟和冰凍組織常規(guī)HE染色，觀察食管癌（Ca）的病理形態(tài)分型、分化程度以及浸潤深度等情況，觀察食管腫瘤旁粘膜組織學類型：異型增生、單純增生、正常鱗狀上皮分別標記為D、H、N。
　　

5、2.gDNA提?。盒迈r標本粘膜下肌肉（M）可直接提取gDNA，其余新鮮組織冰凍切片后HE染色，挑選各例N、H、D、Ca做連續(xù)切片，顯微切割后提取基因組DNA，檢測DNA濃度和純度。
　　3.Real-time qPCR：檢測N/M、H、D、Ca樣本gDNA中BCL-6基因擴增的情況。
　　4.IHC染色：采用EnVision二步法檢測N、H、D、Ca中BCL-6蛋白的表達強度。
　　5.圖像采集：圖像采集系統(tǒng)使用Lei

6、ca DMRXA2全能顯微鏡和Leica IM50圖像采集軟件。
　　6.統(tǒng)計分析：應用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件SPSS19.0，采用了非參數(shù)檢驗、卡方檢驗和Spearman相關(guān)分析。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義（在N、H、D、Ca組間兩兩比較時，采用Bonferroni法調(diào)整檢驗水準，P<0.0083有統(tǒng)計學差異），P<0.01有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.BCL-6基因相對拷貝數(shù)在N/M、H、D、Ca中均值分別為

7、1.0、0.7、2.0、2.3，BCL-6基因的相對拷貝數(shù)與食管鱗狀上皮癌變過程之間存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.001，Spearman相關(guān)系數(shù)rs=0.352）；且兩兩比較發(fā)現(xiàn)H與N/M、H與D、H與Ca的BCL-6基因相對拷貝數(shù)存在統(tǒng)計學差異（P<0.0083）。在癌組織中，BCL-6基因相對擴增率為60.5％（26/43）。
　　2.BCL-6蛋白表達水平與食管鱗狀上皮癌變過程之間存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.001，Spearman

8、相關(guān)系數(shù) rs=0.442）；且BCL-6蛋白的陽性表達率在N和Ca之間有統(tǒng)計學差異（P<0.0083）。
　　3.BCL-6基因的相對拷貝數(shù)或BCL-6蛋白表達水平與食管癌患者性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期無關(guān)。（P>0.05）
　　結(jié)論：
　　1.在潮汕食管癌變過程中，普遍存在BCL-6基因拷貝數(shù)逐漸增高的現(xiàn)象。本研究中，BCL-6基因在癌組織的相對擴增率為60.5%。